7.5. Mesterséges kromoszómák (PAC, BAC, YAC, HAC)

A géntechnológia fejlődésével megjelent az igény egy olyan vektor típusra, amelybe genom-szintű analízisekhez szükséges, méretét tekintve igen nagy inszerteket (>100 kbp) lehet beépíteni és klónozni. Ezt a célt elérendő tervezték meg az ún. mesterséges kromoszómákat.

Az első ilyen mesterséges kromoszómához a P1 E. coli fág genomja adta az alapot. A P1 fág a λ-fággal ellentétben lizogén életciklusa alatt a saját DNS-ét nem integrálja a gazdaszervezet genomjába, hanem extrakromoszomálisan, episzómaként szaporodik a gazdasejttel együtt. A vírus genomja 93 kbp méretű kettős szálú lineáris DNS, az E. coli-ba bejutva azonban cirkularizálódik. A vírus genomját felhasználva kb. 100-300 kbp mérettartományban lehet idegen DNS-t beépíteni a P1 fág-alapú mesterséges kromoszómába (PAC: P1-derived Artificial Chromosome). A gyakorlatban a PAC konstrukcióba restrikciós endonukleáz hasítóhelyek segítségével beépítik az inszerteket, majd elektroporációval a sejtbe juttatják.

A bakteriális mesterséges kromoszóma (BAC) család az E. coli baktérium F-faktor episzómájának módosított változata. A BAC-t szintén nagyméretű inszertek befogadására fejlesztették ki, s még a PAC-nál is nagyobb, akár 350 kbp méretű DNS darabokat is bele lehet építeni. A BAC és PAC közös vonása, hogy mindkét vektor tartalmaz a replikációhoz szükséges bakteriális géneket, valamint szelekciós markereket (pl.: antibiotikum-rezisztencia géneket), amelyek lehetővé teszik a mesterséges kromoszómát tartalmazó sejtek kiválasztását. A replikációjuk a bakteriális kromoszómához kötött, azaz egy sejtben általában csak egy kópiában fordulnak elő („szigorú”, azaz stringens replikáció). Ez a tulajdonság nagyméretű rekombináns DNS-ek esetében hasznosabb, mint a nagy kópiaszám, ugyanis így kisebb valószínűséggel történik homológ rekombináció, a konstrukció stabilabb marad a felszaporítás során.

A harmadik mesterséges kromoszóma típus eukarióta eredetű, ugyanis a sörélesztő gomba, a Saccharomyces cerevisiae genom tulajdonságait örökölte meg. Élesztő mesterséges kromoszómákat (YAC: Yeast Artificial Chromosome) használtak eleinte a Humán Genom Program során is, mivel az előbb említett PAC és BAC vektorokkal szemben akár Mbp nagyságú DNS inszerteket is képes tárolni, így az emberi genom teljes lefedéséhez elegendő kb. 10000 élesztőklón. (Később azonban a YAC klónok instabilitása miatt teljesen elhagyták ezek használatát.) Az előbbi kettő mesterséges kromoszómával szemben a YAC nem cirkuláris, hanem lineáris felépítésű. Rendelkezik az eukariótákra jellemző centromer és telomer régiókkal is, amelyek megakadályozzák a vektor letörését és más DNS darabbal való kapcsolódását. A YAC tartalmaz minden olyan szakaszt, amely a kromoszóma replikációjához és az utódsejtbe kerüléshez (partíció) szükséges. Ezeken a szakaszokon kívül a YAC vektor rendelkezik még egy, a gazdasejtben működőképes replikációs origóval is. A YAC vektor hátránya a másik két mesterséges kromoszómával szemben, hogy mivel eukarióta gazdasejtben tartják fenn, így a rekombinációs folyamatoknak jobban ki van téve, ezen kívül a konstrukció létrehozásakor gyakrabban alakulnak ki konkatamer inszertek.

Végül meg kell emlékeznünk a humán mesterséges kromoszómákról (HAC: Human Artificial Chromosome) is, mint a legkomplexebb vektor típusról, amely ígéretes eszköz a génterápia számára is, mint „génszállító” molekula. Megjegyzendő, hogy az első emlős-alapú mesterséges kromoszómát a Szegedi Biológiai Központban Hadlaczky Gyula (1948-2013) állította elő, akinek több évtizedes munkája lehetővé tette, hogy ezt a géntechnológiai eszközt ma már emlős sejtvonalakban gyógyszermolekulák termelésére, növényekben a bioüzemanyag-előállítására is fel lehet használni (ld. 15. fejezet). Mitotikusan stabil HAC-ot létre lehet hozni meglévő kromoszómákból és de novo is (telomer és centromer szekvenciák kellenek hozzá, az utóbbiakon funkcionális kinetokórral). Méretük 1-10 Mbp között lehet, és a HAC-ba beépíthető inszertnek potenciálisan nincs mérethatára.