7.6. Élesztő és egyéb eukarióta vektorok és gazdasejtek

Az eukarióta rendszerek bevonása a géntechnológiába hamar megkezdődött, hiszen világos volt, hogy amennyiben a rekombináns DNS-t be lehet juttatni egy eukarióta sejtbe, a baktériumoknál megismert elvek alapján bármilyen sejtben fenn lehet tartani és akár ki is lehet fejezni idegen géneket. Az első nem prokarióta vektor típus a Saccharomyces cerevisiae sörélesztőben talált, ún. 2-mikronos gyűrű nevű plazmid, amely egy autonóm módon replikálódó DNS molekula. Van replikációs origója (ARS: Autonomously Replicating Sequence), és ún. REP génjei, amelyek kis extrakromoszomális kópiaszámot biztosítanak úgy, hogy csak akkor választják szét a plazmid replikációt az élesztő genomjának megduplázásától, amikor a plazmid kópiaszáma lecsökkent a sejtben. Ekkor beindul a plazmid független replikációja, amely addig tart, amíg a kópiaszám el nem éri a sejtenkénti 30-50 darabot. A 2-mikronos gyűrűt YEp-nek is nevezik, azaz élesztő episzomális plazmidnak (yeast episomal plasmid), amelyeken belül két típust különböztetünk meg. Az első az élesztő replikálódó plazmid, YRp (yeast replicating plasmid), amelyek tartalmazzák a 2-mikronos gyűrűre jellemző ún. ARS szekvenciát, ami biztosítja az autonóm replikációt. Ennek a típusnak a hátránya, hogy a sejt osztódásakor nem biztosított a nagy kópiaszám, és a vektor utódsejtbe történő átkerülése. A másik csoport az élesztő integrálódó plazmid, YIp (yeast integrating plasmid), amely a YRp-vel ellentétben a hordozott információt beépíti az élesztő genomjába és azzal együtt replikálódik, valamint osztódáskor az utódsejtbe is átkerül. Az élesztő vektorokkal az expressziós rendszerek kapcsán a 13.1.6. fejezetben foglalkozunk részletesebben.

A plazmid típusú vektorokon kívül az eukarióta gazdaszervezeteket is transzformálhatjuk vírus alapú vektorokkal. A legtöbb vírus alapú rendszer esetén szükséges egy köztes prokarióta átmeneti rendszer használata is, mivel a klónozás mindig E. coli-ban történik. Ezeket a kettős replikon típusú vektorokat shuttle bináris vektornak hívják.

Az eukarióta vektor-gazda rendszerek között említésre érdemes a rovarsejtek használata bakulovírus, azaz rovar-specifikus vírus-alapú vektorok alkalmazásával. Mivel a fő felhasználási területük a heterológ génexpresszió, részletesebben ott lesz róluk szó (ld. 13.2. fejezet).

Növényi sejtek transzformálására (transzgenikus növények előállítására) egy növényi parazita, az Agrobacterium tumefaciens tumor indukáló (Ti) plazmidját alakítják bináris vektorrá. A Ti plazmid vektorként való alkalmazását részletesen a 14.4.4. fejezetben tárgyaljuk.

Az emlős gazdaszervezethez használt vektorok az esetek többségében vírus eredetűek. A leggyakrabban használt vektorok SV40-, adeno-, retro-, vagy vakcina vírusokon alapulnak. Az SV40 a legkorábban leírt és legáltalánosabban használt emlős vírus vektor. Mérete kicsi, a gömb alakú kapszidfejben egy 5,2 kbp méretű cirkuláris DNS található. A kis méret előnyös, ha in vitro beavatkozást végzünk, de hátrányos olyan szempontból, hogy a genomon nincsenek felesleges részek, melyeket helyettesíteni lehetne a klónozandó DNS-sel. Ennek megoldása az volt, hogy a vírus késői génjeit a klónozandó DNS-re cserélték. A késői szakasz hiánya a vírusok termelésének hiányához vezet. Ennek elkerüléséhez a vírustermelést egy segédvektor (helper vírus) alkalmazásával oldották meg, amely tartalmazza a rekombináns vírusból hiányzó géneket. Ezt követően a vírus lítikus életciklusából adódó sejtpusztító tulajdonságát kellett kiküszöbölni, amelyet úgy oldottak meg, hogy kifejlesztették a nem lítikus SV40 vírustörzset és mellé egy speciális gazdasejt vonalat, amelyben fenntartható a vektor.

Emlős vektorokként adenovírusokat is használhatunk. Az adenovírusok az emlős szervezetekben normális körülmények között enyhe lefolyású megbetegedéseket okoznak. A laboratóriumi gyakorlatban az adenovírusokat általában expressziós vektorként használják fel. Alkalmazásuk során a klónozandó fehérje génjét beépítik a vírusgenomba, majd az in vitro becsomagolt vírussal fertőzik a gazda organizmust. Az adenovírusok más vírusokhoz hasonlóan génjeiket képesek úgy bekapcsolni, hogy nagy kópiaszámban replikálódjanak, ebből adódóan a gének által kódolt fehérje is nagy mennyiségben fog termelődni. A vakcínia vírus a bárányhimlő vírus rokona, azonban ártalmatlan és biztonságos, amelyet a gyakorlatban több területen is alkalmaznak. Számos sejtvonalat képes fertőzni és nagy előnye, hogy nagyméretű idegen DNS fragmentumokat lehet beleépíteni. A retrovírusok RNS genommal rendelkeznek. A különböző RNS vírusok felépítése igen hasonló, az RNS genom egy középső magban helyezkedik el, ahol a reverz transzkriptáz enzim és különböző szerkezeti fehérjék is megtalálhatók. Ezt a magot lipidburok veszi körül. A retrovírusok vektorként való alkalmazása igen sokrétű, mivel szinte minden állatfajnál alkalmazhatók célgének sejtmagba juttatására, ahol az a gazdasejt genomjába integrálódva kifejeződik. Az emlős gazdasejtekben használható vírus-alapú vektorokról további részleteket a 13.3. fejezetben olvashatnak.