8. fejezet - Rekombináns DNS könyvtárak

Tartalom

8.1. A könyvtárak típusai
8.2. Genomiális DNS könyvtárak
8.2.1. A genomiális könyvtárak létrehozásáról általában
8.2.2. Könyvtár vektorok
8.2.3. λ-fág könyvtárak
8.2.4. Kozmid könyvtárak
8.2.5. Mesterséges kromoszóma könyvtárak (BAC és YAC)
8.2.6. Genomiális könyvtárak felhasználási területei
8.3. cDNS könyvtárak
8.3.1. cDNS könyvtárak létrehozása
8.3.2. cDNS könyvtárak szűrése és fenntartása
8.3.3. cDNS könyvtárak felhasználási területei
8.4. További olvasnivaló a fejezethez

A gének és az azokról termelődő fehérjék vizsgálata útjában az 1970-es évekig komoly akadályt jelentett az, hogy a kutatók nem tudták a géneket megfelelő tisztaságban és mennyiségben izolálni. A rekombináns DNS technológiák fejlődése az 1970-es évek végére lehetővé tette az egyes gének különböző vektorokba történő klónozását (ld. 2. és 4. fejezet). A vizsgálni kívánt gént tartalmazó vektort a megfelelő gazdasejtbe juttatva a gén illetve az arról termelődő fehérje nagy mennyiségben, tisztán előállítható. Ez lehetővé tette akár egész genomok DNS szekvenciájának meghatározását, a gének működésének, szabályozásának megismerését és a génekről termelődő fehérjék biokémiai módszerekkel történő vizsgálatát.

A rekombináns DNS technológiák nemcsak egyedi gének és fehérjék vizsgálatára alkalmas rendszerek létrehozására használhatóak. Ugyanezek a technikák alkalmasak rekombináns DNS könyvtárak létrehozására is. Ezek a könyvtárak hatalmas mennyiségű DNS-ben kódolt információt tartalmazhatnak. A könyvtár létrehozása során először a klónozni kívánt DNS megfelelő méretű fragmentumait állítják elő, majd ezeket a fragmentumokat klónozzák a választott vektorba. Az így létrejövő könyvtár tehát a DNS különböző részleteit tartalmazó klónok összessége. Az egyes klónok, amelyek a klónozott DNS más-más részletét tartalmazzák, megfeleltethetőek egy hatalmas könyvtárban elhelyezett különböző könyveknek, innen ered a rekombináns DNS könyvtár elnevezés. A rekombináns DNS könyvtárból a vizsgálni kívánt gént tartalmazó klónt vagy klónokat különböző, később részletezett technikák segítségével ki lehet választani, és a többi klóntól el lehet különíteni. Ez az eljárás a könyvtárak szűrése, angol eredetű kifejezéssel szkrínelés. Ezáltal a vizsgálatokat tiszta klónokon lehet elvégezni. Az egész DNS könyvtár vagy az egyes kiválasztott klónok a megfelelő gazda rendszerben szaporíthatóak, azaz a DNS könyvtár bizonyos értelemben állandó forrása a specifikus klónoknak is.

8.1. A könyvtárak típusai

Ahogy a hagyományos könyvtáraknak, úgy a DNS könyvtáraknak is különböző típusai vannak. A könyvtárak csoportosításának legfontosabb szempontjai a könyvtár készítése során felhasznált DNS forrása, és a felhasznált vektor. Az úgynevezett genomiális könyvtárak klónjainak összessége egy adott élőlény teljes genomját, vagy annak egy nagyobb részét, például egy kromoszómát tartalmaz. Az úgynevezett cDNS (complementary DNS) könyvtárak egy adott sejttípusban egy adott pillanatban kifejeződő fehérjéket kódoló érett mRNS-ek szekvenciáit tartalmazzák. Egy élőlény különböző típusú sejtjeiben különböző fehérjék fejeződnek ki, így az ezekből készített cDNS könyvtárak is különbözőek lesznek. Egy adott DNS könyvtár tulajdonságait és felhasználhatóságát meghatározó másik fontos tényező az, hogy az adott könyvtár milyen vektor használatával készült. Az egyes vektorok más-más méretű inszertek befogadására alkalmasak. Ez alapvetően meghatározza azt, hogy egy könyvtár milyen jellegű kísérletek során használható. Ebben a fejezetben a különböző típusú könyvtárak létrehozásának lépései, az alkalmazott vektorok, valamint a könyvtárak felhasználásának módjai kerülnek terítékre.