8.2. Genomiális DNS könyvtárak

8.2.1. A genomiális könyvtárak létrehozásáról általában

Genomiális könyvtár létrehozása során az előzőleg izolált genomiális DNS-t megfelelő méretű fragmentumokra kell darabolni. A DNS fragmentálása kivitelezhető restrikciós endonukleázokkal, vagy fizikai módszerekkel, például ultrahang alkalmazásával (szonikálás). A felhasználható fragmentumok méretét a könyvtár készítés során alkalmazott vektor határozza meg, ezért előnyös, ha a folyamat során keletkező átlagos fragmentum méretet a kutató meg tudja határozni.

Meg lehet-e becsülni, hogy adott inszert méretnél és ismert genom méretnél hány rekombináns klónból kell állnia a könyvtárunknak? Igen, sőt azt is megadhatjuk előre, hogy milyen valószínűséggel fogja tartalmazni a könyvtár a teljes genom szekvenciát. Az ideális cél 100%, ám ez nem érhető el, csak megközelíthető. Legyen a kívánt valószínűség 99%, ez gyakorlatilag teljes lefedettséget fog eredményezni. Válasszuk a humán genomot (3x109 bp), valamint egy olyan vektort, amelybe 105 bp méretű inszerteket lehet beépíteni. Az alábbi képlettel számolunk:

N = ln(1-p)/ln[1-(I/G)]

ahol N a rekombináns klónok száma, p a teljes lefedettség valószínűsége, I az inszert méret és G a genom mérete. A fenti példa esetén:

N = ln(1-0,99)/ln[1-(2x105/3x109)] = 70.000

azaz 70 ezer egyedi klónból kell állnia a könyvtárnak, hogy nagy valószínűséggel lefedje a 23 kromoszómánkon tárolt teljes genetikai információt.

A restrikciós endonukleázokkal történő fragmentálás esetén a megfelelő enzim kiválasztásával elérhető, hogy a legtöbb fragmentum a kívánt mérettartományban keletkezzen. Az enzim kiválasztásához tudni kell, hogy az egyes enzimek hasítóhelyei eltérő gyakorisággal fordulnak elő a fragmentálni kívánt célpont DNS-en.

Amennyiben a bázisok véletlenszerű eloszlásban fordulnának elő a DNS szekvenciában, úgy egy tetszőleges 4 nukleotidból álló restrikciós hasítóhely 256 bázisonként ismétlődne, egy 6 karakteres megközelítőleg 4 kilobázisonként, míg egy 8 karakteres nagyjából 66 kilobázisonként fordulna elő. A valóságban a helyzet az, hogy a bázisok eloszlása nem véletlenszerű. Például egy GC gazdag genomban egy AT gazdag szekvencia motívumot felismerő restrikciós enzim hasítóhelyei véletlen eloszlás esetén a vártnál távolabb lehetnek egymástól. Az emberi genomban például a 8 karakteres szekvenciát felismerő enzimek közül az SwaI hasítóhelye a véletlenszerű eloszlás esetén vártnál gyakrabban fordul elő, míg az FseI, AscI és NotI enzimek hasítóhelye jelentősen ritkább. A helyzetet tovább bonyolítja, hogy a restrikciós endonukleázok nem egyforma valószínűséggel hasítják a DNS-t az összes hasítóhelynél. Ezt például a szubsztrát DNS komplex szerkezete határozza meg. Ezért az alkalmazott enzim a könnyen hozzáférhető hasítóhelyeket hamar, míg a nehezen hozzáférhető hasítóhelyeket csak hosszabb inkubálás alatt képes elhasítani.

A fent leírtak illusztrálják, hogy számos szempontot figyelembe kell venni a kívánt eredmény eléréséhez. Ilyen szempontok a megfelelő restrikciós enzim kiválasztása, valamint a DNS fragmentálás körülményeinek, nevezetesen a reakció időtartamának vagy az alkalmazott enzim koncentrációjának megválasztása. Mindazonáltal a restrikciós endonukleázok felhasználásával lehetőség van a kívánt méretű és könnyen vektorba építhető DNS fragmentumok előállítására. A genomiális DNS könyvtárak előállítása során általában arra törekednek, hogy a hasítóhelyeknek csak egy részén következzen be hasítás (részleges fragmentálás). Így egymással átfedő DNS szakaszok jönnek létre, azaz a keletkező könyvtár tagjai egymással átfedő inszerteket hordoznak. Az egyes klónok által hordozott inszertek közti átfedés a genomiális könyvtárak fontos tulajdonsága.

A megfelelő méretű fragmentumokat ezután a többitől elválasztják. Ez általában agaróz gélelektroforézissel történik. A DNS-t a gélből izolálják, majd a választott vektorba klónozzák. Ezzel létrejön a rekombináns DNS könyvtár, azaz a klónozott DNS különböző szakaszait tartalmazó vektor klónok (illetve a rekombináns DNS-ek) összessége. A könyvtárat ezután a vektornak megfelelő gazdaszervezetbe, általában E. coli, vagy ritkábban S. cerevisiae sejtekbe juttatják (ld. 4.3. fejezet) a könyvtárat alkotó vektorok szaporítása céljából (az utóbbira példa az élesztő két-hibrid rendszer használata, ld. 17.1. fejezet). A genomiális könyvtárak létrehozásának általános sémáját a 8.1. ábrán mutatjuk be.

8.1. ábra: Genomiális könyvtárak létrehozásának általános sémája

8.2.2. Könyvtár vektorok

A könyvtár legfontosabb paramétereit a választott vektor határozza meg. A befogadható inszert méreten kívül a vektortól függ többek között az is, hogy milyen gazda rendszerben tartható fenn és szaporítható a könyvtár. Ezért mindenképpen szót kell ejteni az egyes vektorcsaládok könyvtárkészítés szempontjából releváns tulajdonságairól.

A korábban részletesen bemutatott plazmid vektorok (ld. 7.2. fejezet) elvileg alkalmasak bármilyen típusú könyvtár befogadására, azonban van néhány olyan alkalmazhatósági korlátjuk, ami miatt mégsem használjuk őket genomiális könyvtárak készítésére. Az egyik ilyen probléma az, hogy a plazmidokkal való transzformálás hatékonysága nagyon alacsony, és a plazmid méretének növekedésével ez a hatékonyság tovább romlik. Ezen kívül a nagy inszertet tartalmazó plazmidok nem tarthatók fenn stabilan, ugyanis több példányban vannak jelen a sejten belül, és egymás közti rekombinációs folyamatok révén hajlamosak elveszteni az inszert egy részét, illetve átrendezni azt. A plazmidok egyébként alkalmasak nagyobb, akár 10-15 kbp méretű inszertek befogadására, azonban a transzformáció rossz hatékonysága és a nagy inszertek instabilitása miatt kielégítően működő, azaz változatlan információtartalommal fenntartható plazmid könyvtárat csak sokkal kisebb, 3-5 kbp méretű inszertek alkalmazásával lehet létrehozni. A plazmidoknak ezek a hátrányos tulajdonságai ösztönözték a kutatókat a hatékonyabban transzformáló, és nagyobb inszertek befogadására képes vektorok fejlesztésére (ld. 7. fejezet).

8.2.3. λ-fág könyvtárak

A λ-fágot az 1950-es évek óta intenzíven tanulmányozzák. Életciklusa, génjeinek szabályozása részleteiben is jól ismert. Ez tette lehetővé, hogy módosításával számos, a mikrobiális genetikai, molekuláris genetikai és molekuláris biológiai kutatásokban használható eszközt fejlesszenek ki (ld. 7.3.1. fejezet). A λ-fág helyspecifikus (int) és homológ (Red) rekombináz rendszereit elterjedten alkalmazzák rekombináns DNS konstrukciók és genetikailag módosított élőlények előállítására (ld. 14.és 15. fejezetek). Ezen kívül a λ-fág genom egyszerű módosításokkal klónozó vektorrá alakítható át. A λ-fág alapú klónozó rendszerek nagy előnye a plazmidokkal szemben az, hogy segítségükkel a rekombináns DNS konstrukciót a λ-fág fertőzés folyamatának hatékonyságát kihasználva lehet a gazdasejtekbe juttatni. A fág fertőzés hatékonysága a plazmiddal való transzformálásnál kb. három nagyságrenddel nagyobb.

8.2.3.1. λ-fág könyvtárak létrehozása

A λ-fág alapú helyettesítő vagy szubsztitúciós klónozó vektorok 25 kbp méretű inszertek befogadására képesek annak függvényében, hogy a fág genomjának mekkora, a lítikus ciklusban való szaporodáshoz nem nélkülözhetetlen részét távolították el az adott rendszerben. Genomiális könyvtárak létrehozására alkalmas vektorok pl. a lEMBL3/4, a lDASH II és a lFIX II.

A λ-fág könyvtár létrehozása során a genomiális DNS-t ragadós véget eredményező restrikciós endonukleázokkal hasítják, majd a megfelelő méretű DNS fragmentumokat izolálják. A λ-fág vektort olyan restrikciós enzimmel kezelik, ami a genomiális DNS fragmentumain kialakított ragadós végekkel komplementer végeket eredményez. A karokat ezután megtisztítják a köztes, úgynevezett kitöltő (stuffer) szekvenciától. A kitöltő szekvenciára azért van szükség, hogy az „üres”, eredeti állapotú vektor mérete megfelelő legyen ahhoz, hogy az azt tartalmazó fágrészecskék fertőzőképesek legyenek.

A nagyobb inszertek befogadására képes úgynevezett helyettesítő λ-fág vektorok olyan tulajdonságokkal vannak felruházva, amelyek lehetővé teszik a kitöltő szekvenciát tartalmazó, eredeti állapotú klónok elleni szelekciót. Az egyik lehetőség, hogy a kitöltő szekvenciáról annak vektoron belüli orinetációjától függetlenül termelődnek azok a fehérjék, amelyek jelenléte gátolja a fágok lítikus ciklusát úgynevezett P2 profágot tartalmazó baktérium törzsekben. Ezeket a vektorokat P2 profágot tartalmazó törzsben használva az E. coli pázsiton nem képeznek plakkot azok a klónok, amelyek véletlenül a kitöltő szekvenciát tartalmazzák. Ilyen vektort eredeti állapotában előállítani nyilvánvalóan csak P2 profágot nem tartalmazó törzsben lehetséges. Egy másik lehetőség a kitöltő szekvencia újra beépülése elleni szelekciónak az, ha a kitöltő szekvencia két oldalán egymással megegyező poliklónozó helyek vannak egymáshoz képest fordított orientációban. Egy ilyen vektort két, a poliklónozó helyen belül hasító enzimmel kezelve a keletkező karok az egyik, míg a kitöltő szekvencia a másik enzim által generált, egymással nem kompatibilis tapadós végekkel fognak rendelkezni. Az így kezelt vektor karok közé a kitöltő szekvencia nem tud újra beépülni. A λEMBL3 vektor lehetőséget ad a kitöltő szekvencia újra beépülése elleni szelekció mindkét módjára (ld. 8.2. ábra).

8.2. ábra: Rekombináns λ-fág konstrukcióra történő szelekció

A genomiális DNS-t restrikciós enzimekkel darabolják, majd a fragmentumok DNS szálainak 5’-végéről a foszfátcsoportot eltávolítják, hogy a ligálás során eredetileg nem szomszédos szakaszok ne kapcsolódhassanak össze. A vektor karokat és a genomiális DNS-t a kezelést követően összekeverik, és DNS-ligáz segítségével kovalensen összekapcsolják. A reakció során hosszú konkatamer DNS molekulák keletkeznek, amelyek a fág lítikus ciklusban való szaporodáshoz szükséges összes génből, a virionba pakolódáshoz szükséges cos szekvenciákból, valamint a vizsgált genom egy-egy részletéből felépülő ismétlődő egységekből állnak.

A DNS könyvtárat ezután in vitro fág burokba csomagolják (in vitro pakolás; ld. 8.3. ábra). Ez úgy történik, hogy a könyvtárat összekeverik E. coli sejtek kivonatával, ami tartalmazza a preformált fág burok fej és farok egységeket, valamint a DNS fejekbe pakolását elvégző fehérjéket (in vitro pakoló extraktum). Ezt a kivonatot olyan fággal (lA-) fertőzött sejtekből lehet készíteni, amelyek genomjában mutációval elrontották a DNS virionba csomagolásához nélkülözhetetlen „A” fehérje génje, azaz a burok létrejön a fertőzött sejtben, de a fág DNS nem tud pakolódni. Ezt a sejtkivonatot kiegészítik tisztított A fehérjével, majd a rekombináns DNS-sel. A DNS a cos szekvenciáknál elhasad és a létrejövő molekulák burokba csomagolódnak. Ezzel létrejön a genomiális λ-fág könyvtár.

8.3. ábra: Rekombináns λ-fág in vitro pakolása

A rekombináns DNS-t tartalmazó fágok könyvtárából hígítási sort készítenek, majd ennek egyes tagjaival E. coli sejteket fertőznek és a sejteket 37°C-on inkubálják. A fertőzést követően 10-15 perccel a sejteket 45-48°C hőmérsékletű, 0,6-0,8% agart tartalmazó tápoldatban, ún. top agarban felveszik, majd előmelegített agarlemez felszínére terítik szét. Így a sejtek pázsitot alkotnak, amin tarfoltnak (más néven plakk) nevezett világosabb vagy áttetsző foltok figyelhetőek meg ott, ahová a szétterítés során fággal fertőzött sejt került. A fertőzött sejtből ugyanis a sejt pusztulásakor a környezetébe jutnak az új fágok, amik a szomszédos sejteket fertőzik és elpusztítják azokat, miközben újabb fág részecskék termelődnek. Ezért a fertőzött sejtek közelében nem tudnak osztódni a sejtek, ez figyelhető meg plakkok formájában. A plakkokból izolálható fágok egy rekombináns DNS klónt képviselnek. A fertőzéshez használt fág hígítás és a fertőzés után keletkezett plakkok száma alapján meghatározható a könyvtár fág koncentrációja, azaz titere is, aminek ismeretében kiszámítható, hogy a könyvtárat milyen mértékben kell hígítani, és hány agar lemezt kell készíteni, hogy az összes klón megjelenjen a lemezeken plakkok formájában. Így előállítható a könyvtár az E. coli pázsiton plakkok formájában.

8.2.3.2. λ-fág könyvtárak szaporítása, a könyvtár fenntartása

A DNS könyvtár összes tagjának nagy mennyiségben való előállításához a könyvtárral E. coli sejteket kell fertőzni. A fertőzött sejtek az őket fertőző klónt 100-200 példányban állítják elő, és a frissen termelt fágok újabb sejteket képesek fertőzni. Így a könyvtár tagok könnyen szaporíthatóak. Az viszont korántsem biztos, hogy minden klón ugyanolyan mértékben szaporodik a könyvtár növesztése során. A könyvtárban minden klón egyedi, a baktérium sejteknek különböző nehézségű feladatot jelent ezek szaporítása. A felnövesztett könyvtárban általában vannak az átlagosnál jobban és rosszabbul termelődő, azaz alul- és felülreprezentált klónok egyaránt. Egyes klónok akár ki is halhatnak, ha a könyvtár többször is felnövesztésre kerül, ami értékes információ elvesztését jelenti.

A λ-fág könyvtárak esetében az a legjobb megoldás, hogy a könyvtárat csak egyszer növesztik fel nagy mennyiségben, majd a fágokat izolálják és több adagban lefagyasztják. Így sok kísérletre elegendő mennyiségben és azonos minőségben áll rendelkezésre a könyvtár hosszú időn át. Az együttműködő kutatócsoportok akár meg is tudják osztani egymással a könyvtáraikat, ehhez elég egy lefagyasztott adag fágot elküldeni. Az összes könyvtárra igaz, hogy megfelelő, glicerinnel kiegészített oldatban lefagyasztva hosszú ideig tárolhatóak.

8.2.3.3. A λ-fág könyvtárak szűrése (szkrínelése) plakk hibridizációval

A korai könyvtárakat, és a modern könyvtárak nagy részét is azért állítják, állították elő, hogy adott géneket és azok szabályozó régióit izolálják további vizsgálatok céljából. A keresett gén szerencsés esetben akár több klón inszertjében is jelen lehet teljes hosszúságában, azonban gyakran előfordul, hogy a keresett információt több, egymással átfedő inszertet tartalmazó klón együttese tartalmazza. Ez az egyik oka annak, hogy általában arra törekednek a könyvtárkészítés során, hogy az inszertek egymással átfedjenek.

A könyvtárat szűrni (szkrínelni) kell, hogy a rengeteg klón közül azonosítsuk azokat, amelyek a keresett információ egészét vagy részleteit tartalmazzák. A szkrínelés gyakran alkalmazott módja specifikus egyszálú DNS vagy RNS próbák használatán alapul és plakk (tarfolt) hibridizációnak hívjuk (ld. 8.4. ábra). A szűrés első lépéseként a fág könyvtárat E. coli sejtekbe kell juttatni, és olyan sejtpázsitot tartalmazó lemezeket kell készíteni, amelyeken 150-200-fág plakk keletkezik. Ezt követően a lemezekre nitrocellulóz membránt fektetnek. Minden plakkból kerülnek fágok a membránra, így azon létrejön az eredeti lemez lenyomata. Ezután a membránokat nátrium-hidroxiddal kezelik, hogy a fágok fehérje burkát és a DNS-t denaturálják. A DNS-t ezt követően hevítéssel fixálják a membránokon. Az előkészített membránokat radioaktívan vagy fluoreszcensen jelölt DNS vagy RNS próba oldatába áztatják. A próba szekvenciája komplementer a keresett szekvencia egy részletével, tehát a megfelelő klónok DNS-éhez hibridizál. Radioaktív próba esetén a membránt röntgenfilm segítségével hívják elő, míg fluoreszcens próba esetén a megfelelő hullámhosszon történt gerjesztést követő emissziót detektálják az egyes pontokon. A röntgenfilmen megjelenő, vagy fluoreszcens jelet adó pontok pozíciója a membránon megegyezik az eredeti plakk pozíciójával az agar lemezen, azaz a keresett szekvenciát, vagy annak egy részét tartalmazó klón vagy klónok ezzel a módszerrel azonosíthatók. A módszerhez szükség van a keresett gén szekvenciájának vagy a keresett génhez a genomban közel elhelyezkedő marker ismeretére.

A kiválasztott fágokkal baktérium sejteket fertőznek és friss fágokat termeltetnek, hogy az általuk hordozott genomiális DNS szakasz megfelelő mennyiségben és minőségben álljon rendelkezésre a további vizsgálatokhoz.

8.4. ábra: Plakk hibridizáció

Ha nincs jelen olyan klón a kiválasztottak között, amelyik a teljes keresett szekvenciát tartalmazza, akkor a „kromoszóma séta” (chromosome walking) módszerével azonosítanak és sorba rendeznek több olyan átfedő inszertet tartalmazó klónt, amelyek együttesen tartalmazzák az összes keresett információt (ld. 8.5. ábra).

8.5. ábra: Kromoszóma séta

A kromoszóma séta során szükség van két ismert markerre, amelyek a keresett szekvencia két végén találhatóak. Az egyik próbával szkrínelik a könyvtárat, és olyan klónokat azonosítanak, amelyek a keresett információnak ezt a részét tartalmazzák. Ezután restrikciós térképezéssel feltérképezik az adott fragmentumot, és az első próbától legtávolabbi végével komplementer próbát készítenek, amivel újra szűrik a könyvtárat. Így újabb klónokat találnak, amelyek az új próba szekvenciáját tartalmazzák. A folyamat során kiválasztott, egymással átfedő és sorba rendezett klónok összességét kontignak nevezzük.

8.2.4. Kozmid könyvtárak

A λ-fág vektorok és a felhasználásukkal készített könyvtárak lehetővé tették, hogy 20-25 kbp átlagos inszert méretű könyvtárakat használjanak a genetikai és genomikai kutatások során. Azonban számos gén hossza ennél jelentősen nagyobb lehet, ezért továbbra is fennállt az igény nagyobb inszertet befogadni képes vektorok fejlesztésére, és könyvtárak készítésére való felhasználására. Erre a célra először a kozmid vektorokat hozták létre (ld. 7.4. fejezet).

8.2.4.1. Kozmid könyvtárak létrehozása

Az üres, eredeti állapotú kozmid vektor E. coli sejtekben plazmidként szaporítható, és a plazmidokkal azonos módszerekkel izolálható. A könyvtárkészítési folyamat során a vektort restrikciós endonukleázokkal felnyitják, majd a keletkező 5’-végekről a foszfát-csoportot eltávolítják. A vektort ezután egy másik enzimmel is megemésztik. A reakció során vektor karok jönnek létre, amelyek végeiken cos szekvenciákat tartalmaznak. A vektor molekulákat méret szerint elválasztják a nem megfelelően hasadt DNS molekuláktól. Ezután az emésztett vektort összekeverik a klónozásra előkészített, azaz a megfelelő enzimmel kezelt és defoszforilált genomiális DNS-sel, és ligálják a komplementer DNS végeket. . A ligálás során a λ-fág vektorokhoz hasonlóan konkatamer DNS molekulák jönnek létre. Ezekhez a hosszú DNS molekulákhoz preformált λ-fág fej és farok egységeket és a becsomagoláshoz szükséges fág fehérjéket tartalmazó sejt kivonatot adnak. Ekkor a hosszú DNS molekulák a cos helyeknél elhasadnak és egyesével fág burokba pakolódnak. A megfelelő méretű inszertet tartalmazó vektorok becsomagolódása fertőzőképes fág részecskét eredményez.

A rekombináns kozmid vektorokat tartalmazó fágokat, azaz a kozmid könyvtárat izolálják, majd azokkal baktérium sejteket fertőznek. A sejtben a vektor köralakú molekulává záródik, és plazmidként replikálódik. Sajnos a kozmid vektorok esetében is fennáll annak a veszélye, hogy a nagy inszertek egy része elveszik, amikor a könyvtár tagjai sejtekben vannak fenntartva. A rendszernek megvan viszont az az előnye, hogy ez a veszély a fág burokba csomagolt könyvtár esetében nem áll fenn.

8.2.4.2. Kozmid könyvtárak szaporítása, a könyvtár fenntartása

A kozmid könyvtár klónjainak sokszorosításának első lépéseként a klónokat tartalmazó vírusokkal E. coli sejteket fertőznek, majd rövid növesztés után a sejteket a vektornak megfelelő antibiotikumot is tartalmazó agar lemezekre szélesztik. A lemezeket 37°C-on inkubálják. Az antibiotikum szelekciónak köszönhetően csak a kozmid vektor klónnal transzformált sejtek tudnak osztódni a lemezeken. Másnap a lemezekről a sejteket lemossák a megfelelő tápoldattal és a kozmid vektorokat hordozó sejteket tartalmazó táplevest egy csőben összegyűjtik és alaposan összekeverik. Ezt követően glicerinnel kiegészítik a mintát, szétosztják több adagra, lefagyasztják és -80°C-on tárolják.

A kozmid könyvtárakat baktérium sejtekben, agar lemezek felszínén fenntartani, de a fent leírt módon, „ömlesztve” amplifikálni nem könnyű feladat. Egyrészt a nagy inszerteket hordozó klónok instabilak, másrészt a könyvtárban maradt nem rekombináns, eredeti állapotú kozmiddal, vagy kisebb inszertet tartalmazó vektorral transzformált sejtek kisebb terhet viselnek, ezáltal gyorsabban osztódnak a nagy rekombináns vektort hordozó társaiknál. Vizsgálatok kimutatták, hogy egy 2-3% eredeti vektort tartalmazó kozmid könyvtárban egy amplifikációt követően a sejteknek akár 40%-a eredeti vektort hordozhat. Ezt kiküszöbölni rendkívül sok munkát igénylő módon lehet. Egy lehetséges módszer az összes klón megőrzésére az, hogy az elkészített könyvtárat sejtekbe juttatják, és a sejteket szélesztik agar lemezeken úgy, hogy a lemezeken egyedi, klonális telepek nőjenek. A telepeket ezután egyesével leoltják 96 lyukú sejttenyésztő lemezek táplevessel töltött mintahelyeire. Egy nagy könyvtár esetében több tízezer klónt kell kézzel leoltani, de így biztosítható, hogy minden klón fennmaradjon. A lemezek összes mintahelyéről időnként a sejtek egy része új lemezekre átvihető, és így a könyvtár bizonyos ideig fenntartható. Ez utóbbi művelet robotok segítségével automatizálható. Összességében elmondható, hogy a kozmid könyvtárak esetében megfontolandó lehet a könyvtár ismételt elkészítése bizonyos időközönként, vagy akár minden újabb szkrínelést megelőzően.

8.2.4.3. A kozmid könyvtárak szűrése kolónia hibridizációval

A kozmid könyvtárak szkrínelése során az agar lemezek felszínén növekedő baktérium telepek egy részét nitrocellulóz membránra viszik át, majd a membránt néhány példányban sokszorosítják. A telepek lenyomatát tartalmazó egyik membránt NaOH oldattal kezelik, hogy a sejtek feltáródjanak, majd a DNS-t kémiai módszerrel, vagy hevítéssel fixálják a membránon. A fixált membránokhoz radioaktívan vagy fluoreszcensen jelölt DNS próbákat hibridizáltatnak, így azonosítják a keresett információt tartalmazó klónokat. Az eljárást kolónia hibridizációnak nevezzük. A folyamat tulajdonképpen a legtöbb lépésében nagyon hasonlít a λ-fág könyvtárak plakk hibridizációjához.

A szkrínelés során pozitívnak bizonyult klónok felszaporítása általában nem magától értetődő feladat a kiindulási lemezeken tapasztalt nagy kolónia sűrűség miatt. Ilyen esetekben az eredeti membránon az autoradiogram vagy az előhívott membránról készült fluoreszcens fotó alapján azonosítják azt a régiót, ahol a pozitív klón megtalálható. Ezután a kiválasztott régióban található sejtekkel táptalajt oltanak be és a sejteket szaporítják. A sejteket ezután hígítják és agar lemezen szélesztik úgy, hogy kis klónsűrűségű lemezek keletkezzenek, azaz a másnapra megjelenő telepeket alkotó sejtek egyetlen kozmid klónt hordozzanak. A kis klónsűrűségű lemezeket ezután ismét szkrínelik. A második szűrés során azonosított pozitív klónok már izolálhatóak tiszta formában.

A fent leírt két ciklusban történő szkrínelésre azért van szükség, mert ha a könyvtár összes klónját akarnák széleszteni úgy, hogy klonális telepek nőjenek fel a szűrendő lemezeken, akkor a lemezek száma csillagászati lenne. Összességében sokkal kevesebb munkát jelent az összes klónt szűrni nagy klónsűrűségű lemezeken, majd a pozitív klónokat a fent leírt módon megkeresni a szűrés során kiválasztott régiókban jelen levő klónok közül.

A λ-fág és a kozmid könyvtárak összehasonlítása során a legfontosabb szempontok szerint arra a megállapításra juthatunk, hogy a kozmid könyvtárak a nagyobb befogadható inszert méretének köszönhetően feleannyi klónnal lefedhetnek egy adott genetikai információt.

8.2.5. Mesterséges kromoszóma könyvtárak (BAC és YAC)

Az eddig bemutatott rendszerek által befogadható inszert méret még mindig nem elegendően nagy ahhoz, hogy belátható és könnyen kezelhető mennyiségű klón létrehozásával a vizsgált genomot, vagy annak kiválasztott részét reprezentáló könyvtárakat lehessen készíteni, valamint hogy a leghosszabb géneket, együtt szabályozott géncsoportokat egészében hordozó klónokat lehessen előállítani. Ezt az igényt a mesterséges kromoszóma vektorok kifejlesztése és genomiális könyvtárak készítésére történő alkalmazása elégítette ki. A mesterséges kromoszóma vektorok sokkal nagyobb, néhány száz kbp (BAC), vagy akár két-három Mbp (YAC) méretű inszertek befogadására alkalmasak. Ez többszöröse a korábban bemutatott rendszerek által befogadható inszertek méretének

8.2.5.1. Mesterséges bakteriális kromoszóma (BAC) könyvtárak létrehozása

A BAC vektorok az E. coli F-plazmidjának replikációs origóját tartalmazzák (ld. 7.5. fejezet). Ennek köszönhető, hogy a BAC vektor példányszáma szigorúan szabályozott (stringens), és egy sejtben az osztódást megelőző replikációt leszámítva csak egyetlen példányban fordul elő. A BAC könyvtárakat elterjedten alkalmazzák a genom projektek során a genom nagyobb részleteinek amplifikálása, fenntartása, a genom fizikai térképezése és szekvenálása során (ld. 9.1.2. fejezet).

A BAC könyvtárak létrehozása során alapvetően a korábban már ismertetett technikákat használják. A nagy inszert méret miatt ugyanakkor bizonyos dolgokra nagyobb figyelmet kell fordítani. A genomiális DNS izolálása során kerülni kell, hogy a DNS-re ható nyíróerők következtében, vagy bármi más okból a DNS károsodjon. A DNS szálon bekövetkező nem célzott törések rontják a klónozás hatékonyságát és csökkenthetik az elérhető maximális inszert méretet is. A restrikciós endonukleázzal kezelt DNS fragmentumok méret szerinti elválasztása is más módszerrel történik a száz kbp-os mérettartományban. A kívánt 100-300 kbp tartományban a DNS molekulákat nem lehet méret szerint elválasztani hagyományos gélelektroforézis technikák segítségével. A megoldás a pulzáló-terű gélelektroforézis (PFGE: pulsed field gel electrophoresis) technika alkalmazása (ld. 8.6. ábra).

8.6. ábra: Pulzáló-terű gélelektroforézis

A PFGE során az alkalmazott feszültség iránya adott időközönként változik. Az egyik legegyszerűbb elrendezésben a gél hossztengelyére merőleges irányon kívül a tengelytől mindkét irányban 60°-os szöget bezáró feszültséget alkalmaznak még. A módszer alapja, hogy a feszültség irányának megváltozásakor a kisebb molekulák gyorsabban reagálnak, és kezdenek el a megváltozott iránynak megfelelően mozogni, ezáltal gyorsabban haladnak. Mivel a különböző irányokban egyforma ideig alkalmazzák a feszültséget, ezért a haladás iránya összességében a gél tengelyével párhuzamos marad.

A megfelelő mérettartományba eső DNS molekulák izolálására is több lehetőség van. Az egyik, a DNS molekulákat tartalmazó agaróz géldarab kezelése a polimerizált agarózt lebontó agaráz enzimmel. A DNS-re ható nyíróerők ezzel a módszerrel kizárhatóak. Egy másik módszer az úgynevezett elektroelúció. A DNS-t az izolálást követően koncentrálni is kell. Ez általában dialízissel történik a nyíró erők fellépésének elkerülése miatt.

A BAC vektorokat a klónozást megelőzően restrikciós endonukleázzal felnyitják, majd a DNS végekről a foszfát csoportot alkalikus foszfatáz enzimmel eltávolítják, hogy megelőzzék a vektor önzáródását (ld. 3.4.2. fejezet). A kezelt vektort és a genomiális DNS fragmentumokat ezután összekeverik és ligálják. A könyvtár sejtekbe juttatása vagy kémiai transzformálással, vagy a létrejövő vektorok nagy mérete miatt elektroporálással történik.

8.2.5.2. BAC könyvtárak szűrése és fenntartása

A BAC könyvtárakat a kozmid könyvtárakhoz hasonlóan lehet szkrínelni. A különböző eljárások során jelölt DNS próbákat hibridizáltatnak a klónok membránon fixált DNS-éhez, majd a kiválasztott klónokat izolálják, és tiszta formában szaporítják. A BAC könyvtárak fenntartására szintén alkalmazhatóak a kozmid könyvtárak esetében ismertetett módszerek. Az eredeti agar lemezek lenyomatait tartalmazó membránok, vagy a klonálisan, sejttenyésztő lemezeken növesztett klónok formájában a könyvtár hosszabb időn keresztül, megfelelő minőségben fenntartható.

8.2.5.3. Élesztő mesterséges kromoszóma (YAC) könyvtárak és létrehozásuk

A YAC vektorok a BAC vektorokhoz hasonlóan eredeti állapotukban E. coli sejtekben fenntartható, plazmid szerű cirkuláris DNS molekulák (ld. 7.5. fejezet). Tartalmaznak bakteriális és élesztő replikációs origót, szelekciós markereket a YAC-ot hordozó baktérium illetve élesztő sejtek szelekciójához, valamint multiklónozó helyet is. A YAC vektoroknak rendelkezniük kell a telomer és centromer régiókból származó szekvenciákkal is, ezek ugyanis nélkülözhetetlenek a genomiális DNS szakaszt tartalmazó YAC vektor élesztősejtekben való stabil fenntartásához és az osztódáskor történő pontos szétválásához. A YAC vektorok által befogadható 2-3 Mbp méretű inszertek ideális eszközökké tehetnék őket a genom projektek, genomok térképezése és szekvenálása során, azonban számos olyan hátrányos tulajdonsággal rendelkeznek, ami megnehezíti a YAC könyvtárakkal való munkát.

A YAC könyvtárakban tárolt információ jóval kevésbé stabil, mint a BAC könyvtárakban tárolt. A YAC könyvtárakban gyakran előfordul, hogy az egyes klónok által hordozott inszert nem a genom egyetlen, folytonos régiójának felel meg, azaz kiméra. Ennek oka lehet az, hogy egyetlen YAC vektorba több inszert is beépül a ligálás során, vagy az, hogy a könyvtárral való transzformálás során egyetlen élesztősejtbe több YAC vektor is bejut, és a vektorok között rekombinációs folyamatok játszódnak le. Ezen kívül az inszert egy részének deléciója vagy inverziója is gyakran megfigyelhető. Egyes vizsgálatok szerint a YAC könyvtárakban a klónok akár felére igaz lehet, hogy a hordozott inszert nem felel meg egy folytonos genomiális régiónak. Ez a jelenség kísérletes műtermékeket eredményez, és téves következtetéseket okozhat. A fent felsorolt hátrányok ellenére bizonyos esetekben a YAC vektorba történő klónozás az egyetlen megoldás. Az élesztőben például szélsőségesen magas A-T tartalmú DNS szakaszok stabilabbak, mint bakteriális rendszerekben.

8.2.5.4. YAC könyvtárak fenntartása és szűrése

A YAC könyvtárakat 96 vagy 384 mintahelyes sejttenyésztő lemezeken lehet fenntartani. Ehhez a könyvtárral transzformált és táplemez felszínén növesztett élesztő klónokat egyesével le kell oltani és a sejttenyésztő lemez mintahelyeire kiosztott táptalajba kell oltani. Adott időközönként a sejttenyésztő lemezen nőtt sejtek egy részét új sejttenyésztő lemezekre kimért friss táplevesbe viszik át. A könyvtár ilyen formában 4°C-on néhány hétig tartható el, vagy a mintahelyeket glicerinnel kiegészítve a lemezek le is fagyaszthatóak, így a könyvtár hosszabb ideig is eltartható.

A YAC könyvtárak szkrínelésének leghatékonyabb módja szintén DNS próbák hibridizálásán alapul. A hibridizálás során használt membránt agar lemezek felszínére fektetik, majd a sejttenyésztő lemezeken fenntartott könyvtár klónokat automatizáltan, robotok segítségével felviszik a membránra meghatározott elrendezésben. A klónokat az agar lemezen növesztik, majd a membránt eltávolítják. A membránon az összes klón jelen van szabályos elrendezésben. A membránon levő sejteket ezután a korábban leírtakhoz hasonlóan feltárják, majd a DNS-t denaturálják és fixálják a membránon. A próba hibridizálása és előhívása után azonosíthatóak a membránon és a sejttenyésztő lemezen azok a klónok, amelyek a próba szekvenciáját hordozzák.

8.2.5.5. A BAC és YAC rendszerek összehasonlítása

A mesterséges kromoszóma rendszerek összehasonlítása alapján megállapítható, hogy a könyvtárkészítés során kritikus transzformálási hatékonyság a BAC könyvtárak esetében jelentősen, mintegy két nagyságrenddel jobb, mint a YAC könyvtáraknál. A cirkuláris BAC vektorok kompakt, szuperhelikális szerkezetüknek köszönhetően egyszerűen izolálhatóak, míg a lineáris és nagyobb méretű YAC vektorok gyakran károsodnak a tisztítási folyamat során. A YAC vektorok előnye viszont, hogy még a BAC vektorokhoz képest is hatalmas a befogadható inszertek mérete, valamint bizonyos esetekben a DNS YAC vektorba építve és élesztő sejtekben fenntartva stabilabb, mint bakteriális rendszerben.

8.2.6. Genomiális könyvtárak felhasználási területei

A genomiális könyvtárakat széles körben használják genetikai és genomikai kutatásokban, kiemelten a genom projektekben. A felhasználás célja lehet egy gén, gén klaszter vagy akár a teljes genom fizikai térképének elkészítése, új markerek azonosítása és elhelyezése a térképen, vagy akár a teljes genom szekvenciájának meghatározása. Bármilyen alkalmazás során az első feladat, hogy az éppen keresett információt tartalmazó klónt vagy klónokat a korábban bemutatott szűrési technikák segítségével megkeresik és izolálják. A szkrínelés során kiválasztott klónok által hordozott inszertek vizsgálatának első lépése gyakran a restrikciós térképezés. Ez a módszer hasznos információkat szolgáltat az inszertről a genom szekvenálása során, és akkor is, ha a cél a genom egy adott régiójának azonosítása, amplifikálása és további vizsgálata. A restrikciós térképezés folyamán információ gyűjthető arról, hogy az adott inszertben bizonyos restrikciós endonukleázoknak hány hasítóhelye van, ezek milyen sorrendben, és egymástól milyen távolságban helyezkednek el. Ez az információ azért hasznos, mert a hasítóhelyek helyzetének ismerete egy korábban nem térképezett DNS szakasz fizikai térképének első ismert pontjait adhatja. Ezek a pontok hatalmas segítséget nyújthatnak az inszert több részletben történő szekvenálását követően az egymással átfedő szekvenciák sorba rendezésében, ha a létrehozott restrikciós térkép felbontása megfelelő. (ld. 9.1.2. fejezet)