8.3. cDNS könyvtárak

A cDNS könyvtárak készítésének célja alapvetően más, mint a genomiális könyvtárak esetében. A cDNS könyvtárak a könyvtárkészítés során használt sejttípusban kifejeződő fehérjék érett mRNS szekvenciáiról készült komplementer szálakat tartalmazzák. Ilyen könyvtárakat leginkább adott fehérjék kódoló szekvenciájának előállítására hoznak létre. A cDNS könyvtárból klónozott eukarióta gén intronokat nem tartalmaz. Ennek köszönhetően lehetséges a fehérje bakteriális expressziós rendszerben történő előállítása. A cDNS könyvtárak nem alkalmasak az egyes gének kifejeződésének, az expresszió szabályozásának vizsgálatára, mert a génekhez tartozó szabályozó elemek nincsenek jelen. A cDNS könyvtár elkészítése előtt körültekintően, előzetes ismeretek alapján kell megválasztani azt a sejttípust, amelyben a vizsgálni kívánt fehérjék nagy mennyiségben jelen vannak. A sejttípus megfelelő kiválasztása növeli annak az esélyét, hogy a keresett gének jelen lesznek a könyvtárban.

8.3.1. cDNS könyvtárak létrehozása

A cDNS könyvtárak létrehozásának első fontos lépése a megfelelő sejttípus vagy szövet, illetve az alkalmazott vektor kiválasztása. A cDNS könyvtárak létrehozása során gyakran használt vektorok közé tartoznak az inszerciós és szubsztitúciós λ-fág vektorok, valamint a plazmidok és kozmidok. A cDNS könyvtárak átlagos inszert mérete nem indokolja a mesterséges kromoszóma vektorok használatát.

A kiválasztott sejtekből izolálják az RNS-t, majd az érett mRNS-ek 3’ poli-A farkához hibridizáló oligo-dT primer és reverz transzkriptáz enzim felhasználásával elkészítik az mRNS-ekkel komplementer DNS (cDNS) szálakat. A cDNS molekulák vektorba klónozásához szükség van a létrejövő RNS/DNS hibrid molekulák kétszálú DNS megfelelőinek előállítására. Erre is több módszer áll rendelkezésre. Az egyik leggyakrabban alkalmazott eljárás során a reverz transzkripció termékéhez RN-áz H és DNS-polimeráz enzimet adnak. Az RN-áz H nick-eket (bevágásokat) hoz létre az RNS szálon. A DNS-polimeráz a nick-eknél megjelenő szabad 3’-OH csoportoktól indulva emészti az RNS szálat és létrehozza a DNS másik szálát.

A létrejövő kétszálú DNS-t a vektorba ligálást megelőzően még további kezelésnek kell alávetni. A molekulák végein az egyik szál esetleges túlnyúlását egyszálú-specifikus DNS-exonukleáz enzimmel emésztik, vagy DNS-polimeráz enzimmel feltöltik. A DNS vektorba ligálásához a terméket restrikciós endonukleázzal kell hasítani. Ehhez el kell látni a DNS molekulák végeit a megfelelő enzim hasítóhelyével, valamint biztosítani kell, hogy az enzim csak a végeken hasítson. Ennek érdekében először metil-transzferáz enzimmel kezelik a DNS-t, ami az alkalmazandó restrikciós endonukleáz hasítóhelyeit metilálja, ezáltal megóvja azokat a későbbi hasítástól. Ezt követően a DNS molekulák végeire tompa vég ligálással linkereket illesztenek, amelyek tartalmazzák a restrikciós endonukleáz metilálatlan hasítóhelyet. A választott vektort és a cDNS-t restrikciós enzimmel kezelik, majd az inszerteket a vektorba ligálják. A vektor önmagával való záródásának megakadályozására alkalmazható a vektor foszfatáz enzimmel való kezelése. A cDNS könyvtárkészítés sémáját a 8.7. ábrán mutatjuk be.

8.7. ábra: cDNS könyvtár készítése

8.3.2. cDNS könyvtárak szűrése és fenntartása

A cDNS könyvtárak fenntartásának módját az alkalmazott vektor típusa határozza meg. A különböző vektorok felhasználásával készült könyvtárak fenntartásával kapcsolatos tudnivalók a genomiális könyvtárakkal foglalkozó fejezetben találhatóak.

A cDNS könyvtárak szkrínelésére is alkalmasak a korábban leírt, jelölt DNS vagy RNS próbák hibridizálásán alapuló eljárások. Bizonyos vektorok lehetőséget adnak a könyvtár szűrésének más módjaira is. Az egyik lehetőség az, hogy a vektorba ligált inszertegy promóter mögött helyezkedik el, transzkripcióval átíródik mRNS molekulákba és végül fehérje formában megjelenik a sejtben. Ilyen esetekben lehetőség van specifikus, jelölt ellenanyaggal azonosítani azokat a könyvtár kolóniákat, amelyekben termelődik a klónozni kívánt fehérje, vagy annak az ellenanyag által felismert részlete.

A cDNS könyvtárban előforduló szekvenciák nagy része nem tartalmazza a fehérjét kódoló mRNS teljes szekvenciáját, csak annak egy részét. A teljes hosszúságú cDNS előállításához vagy megkereséséhez a könyvtárat újra kell szkrínelni. Ennek során általában a korábban már azonosított, de nem teljes hosszúságú klón szekvenciájából készített próbát használják. Számos lehetőség van annak megállapítására, hogy az azonosított klón vagy klónok szekvenciája tartalmazza-e a teljes mRNS szekvenciát. Talán a legegyszerűbb az 5’ és 3’ nem-átíródó régiók meglétének vizsgálata. Ha valamelyik hiányzik, akkor biztos, hogy a megtalált információ még nem tartalmazza a teljes mRNS szekvenciát. Ugyanakkor fontos számolni azzal is, hogy egy adott génről alternatív splicing (kivágódás) folyamatoknak köszönhetően többféle mRNS is keletkezhet. Az azonosított és nem-átíródó régiókkal is rendelkező szekvenciákról meg lehet állapítani, hogy a keresett fehérje génjének felelnek-e meg, vagy esetleg alternatív splicing termékek. Ha ismert a fehérje molekulatömege, akkor ellenőrizhető, hogy az azonosított szekvenciáról termelődő fehérje tömege megegyezne-e ezzel.

8.3.3. cDNS könyvtárak felhasználási területei

A cDNS könyvtárak nagymértékben megkönnyítik a vizsgálni kívánt gének fehérje kódoló szekvenciájának izolálását. Az izolált cDNS szekvenciák később változatos kutatásokban, sokféle céllal felhasználhatók. A cDNS könyvtárakat széles körben használják arra, hogy a vizsgálni kívánt fehérjék génjeit olyan formában izolálják, ami alkalmas a fehérje expressziós rendszerben való előállítására.

Az izolált cDNS szekvenciákból jelölt próbák készíthetőek. A próbák segítségével vizsgálható az adott gén expressziójának szintje különböző szövetekben, vagy az expresszió megváltozása különböző kezelések, beavatkozások hatására. Ilyen próbákat széles körben alkalmaznak genomiális DNS könyvtárak szkrínelése során is. Így lehetőség nyílik olyan klónok azonosítására, amelyek a vizsgált fehérje génjét szabályozó régiókkal és intronokkal együtt tartalmazzák. Így a gén elhelyezhető az élőlény genomjának fizikai térképén, valamint lehetőség adódik bizonyos fenotípusok, például öröklődő betegségeket markereivel való kapcsoltság vizsgálatára. A génszabályozó régiókkal együtt történő izolálása lehetővé teszi a génkifejeződés szabályozásának vizsgálatát is.