11. fejezet - In vitro mutagenezis

Tartalom

11.1. Nem-irányított in vitro mutagenezis módszerek
11.1.1. Mutátor baktérium sejtvonalak
11.1.2. Hibát ejtő (error prone) PCR mutagenezis
11.2. Helyspecifikus in vitro mutagenezis módszerek
11.2.1. DNS kazetta mutagenezis
11.2.2. Szelektív templát lebontáson alapú mutagenezis módszerek
11.2.3. PCR alapú irányított mutagenezis módszerek
11.3. További olvasnivaló a fejezethez

Az 1980-as években kialakuló és napjainkig töretlenül fejlődő géntechnológiai módszerekkel a rekombináns fehérjéket kódoló DNS-ben – így a humán fehérjéket kódoló DNS-ben is – mára egyszerűen, olcsón és gyorsan hozhatók létre mutációk, akár irányítottan is. A DNS-en történő változtatás lehet deléció, amikor tetszőleges számú nukleotid eltávolítása történik; inszerció, amikor tetszőleges számú nukleotid beillesztése történik; vagy szubsztitúció, ami egy nukleotid másik nukleotidra való kicserélését jelenti. Az in vitro mutagenezis kidolgozásával beindult a reverz genetika korszaka.

Miért lehet szükség a fehérjéket kódoló DNS vagy a vizsgálandó gének szabályzó elemeinek célzott vagy véletlenszerű megváltoztatására? Egyrészt azért, mert az egyes biológiai folyamatok vizsgálata és megértése gyakran a folyamatok részlépéseinek defektusain keresztül történik. A klasszikus genetikai vizsgálatokban az egyes gének vagy szabályzó elemeinek funkciójára, az adott folyamatok működésére csak azok természetes mutációinak és változásainak fenotípus vizsgálatával volt lehetőség. Az örökítőanyagban bekövetkező változások a természetben azonban nem célzottak és nem érintik az összes régiót, ezért számos esetben a fehérjék, fehérjerészletek vagy génjük szabályozó elemeinek funkciója nem vizsgálható. A kutatók érdeklődésének központjában gyakran az ember áll. A géntechnológiai módszerek kifejlesztése előtt a humán fehérjék funkciójának vizsgálata is csak a természetben előforduló mutációk és rendellenességek vizsgálatával volt lehetséges. Az irányított mutagenezis módszerekkel rekombináns fehérjékben – akár humán fehérjékben is – gyorsan és hatékonyan tudunk véletlenszerű vagy akár célzott változásokat létrehozni. Az egyes aminosavak más kémiai karakterrel rendelkező aminosavakra cserélésével vagy akár nagyobb fehérjerészek mutációjával a fehérjék tulajdonságait megváltoztathatjuk. A megváltozott tulajdonságból következtetni tudunk az adott aminosavnak vagy a fehérjerésznek a fehérje enzimaktivitásában, szerkezetében vagy funkciójában betöltött szerepére.

Az in vitro mutagenezis másik felhasználási területe a racionális fehérjemérnökség, vagy az irányított fehérje evolúció, melyek során irányított vagy nem-irányított mutációs módszerek segítségével fehérje variáns sereget hozhatunk létre (ld. 16. fejezet). Ebből a variáns seregből általunk meghatározott szelekciós körülmények között végeredményben megváltoztatott, valamilyen szempontból számunkra előnyösebb, vagy akár újfajta tulajdonsággal rendelkező fehérjék, enzimek, fehérje inhibitorok szelektálhatók (pl.: proteáz inhibitorok; stabilabb és gyorsabb enzimek).

A rekombináns fehérjék in vitro mutációs módszerekkel történő vizsgálata nagymértékben hozzájárult a modern biológia mai sikerességéhez. A DNS in vitro mutagenezisére mára számos módszert kifejlesztettek. Ebben a fejezetben a teljeség igénye nélkül ismertetésre kerülnek a leggyakrabban használt, a legismertebb és a leghatékonyabb nem-irányított és irányított mutagenezis módszerek. A mutagenezis módszerek kihagyhatatlan lépése és szerves része a mutáns DNS szekvencia ellenőrzése, aminek a legbiztosabb módszere a DNS szekvenálása. A különböző szekvenálási és ellenőrzési módszerekről részletes információ a 5. fejezetben található.

11.1. Nem-irányított in vitro mutagenezis módszerek

Nem-irányított mutagenezis módszerek gyakran használatosak irányított fehérje evolúciós módszerek esetében, mint például az in vitro kompartmentáció, a fág bemutatás vagy a baktérium bemutatás (ld. 16 . fejezet). Az irányított fehérje evolúciós módszerek során a természetben történő evolúciós történéseket utánozva (diverzifikáció, szelekció és replikáció) egy variáns seregből általunk meghatározott körülmények között szelektálódnak a számunkra megfelelő tulajdonsággal rendelkező könyvtártagok. A módszer első lépése a megfelelő variáns sereg létrehozása. A nem-irányított in vitro mutagenezis módszerekkel létrehozott variánsok tulajdonságai a mutáció fajtájától függően akár nagymértékben is eltérhetnek a kezdeti templátként (vázként) használt fehérje tulajdonságaitól. Végeredményben szolubilisabb, szerkezetileg stabilabb vagy akár teljesen újfajta tulajdonsággal, újfajta enzimaktivitással rendelkező fehérjék, enzimek is létrehozhatók.

11.1.1. Mutátor baktérium sejtvonalak

Különféle mutátor baktérium sejtvonalak használatával gyorsan és egyszerűen lehet nem-irányított mutációt létrehozni a vizsgálandó rekombináns fehérje DNS szekvenciájában. A módszer alapja, hogy a rekombináns fehérjét kódoló DNS-t tartalmazó plazmid sokszorosításához használt baktérium sejtvonalakban nem működnek megfelelően a DNS hibajavító rendszerek. Például plazmid vektorok sokszorosításához általánosan használt Escherichia coli baktérium egyik sejtvonalában, az XL1-Red-ben (endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac mutD5 mutS mutT Tn10 (Tetr)) hiányzik a DNS hibajavító útvonalban szerepet játszó három „kulcs” fehérje; a mutS, a mutD és a mutT. A mutS fehérje az „error prone mismatch” hibák javításban, a mutD fehérje a DNS-polimeráz III 3’→5’ exonukleáz aktivitásában, a mutT fehérje az oxidatív folyamatok során történő DNS károsodás javításában vesz részt. A nem megfelelő DNS hibajavítás 5000-szer nagyobb mutációs gyakoriságot eredményez ennél a sejtvonalnál a vad típusú Escherichia coli sejtvonalakhoz képest. A módszer előnye, hogy két egyszerű lépéssel, a plazmidnak a mutátor sejtekbe transzformálásával, majd a sejtek felnövesztése után a már mutáns plazmid DNS-ének kinyerésével gyorsan, sokfajta mutáció (deléció, szubsztitúció, inszerció) létrehozása lehetséges. Egyéb géntechnológiai módszerek, mint restrikciós emésztés, PCR vagy ligálás nem szükséges. A módszer hátránya, hogy a mutációs ráta a mutátor sejtvonalak használata mellett is igen alacsony (0,5 mutáció/kbp). Nagyobb mutációs rátát a sejtkultúra fenntartási idejének megnövelésével lehet elérni. A mutátor sejtvonalak a DNS hibajavító rendszer hiánya miatt azonban igen gyorsan halmoznak fel mutációkat saját genomjukban és a plazmidnak nem a vizsgálandó fehérjét kódoló DNS részében is. Megfelelő méretű variáns sereg létrehozása ezért gyakran ismételt transzformálási és plazmid tisztítási lépéseket igényel.

11.1.2. Hibát ejtő (error prone) PCR mutagenezis

Az egyik leggyakrabban használt nem-irányított mutagenezis módszer az úgynevezett hibát ejtő (error prone) PCR. Alapja, hogy a vizsgálandó fehérjét kódoló DNS szakasz PCR általi sokszorosítása során a DNS-polimeráz számára nem optimális körülményeket használnak. Nem megfelelő körülmények között a DNS-polimeráz mutációs frekvenciája megnő. A felszaporított DNS-ben a mutációk véletlenszerűen keletkeznek, számuk a ciklusszámmal nő. Error prone PCR során általában a Thermus aquaticus baktériumból izolált, alacsony hűségű („low fidelity”) Taq DNS- polimerázt használnak. A Taq-polimeráznak hiányzik a 3’→5’ exonukleáz aktivitása, ezért ha a polimeráz a lánchosszabítás során nem a DNS bázispárosodás szabályainak megfelelő bázist épít be, akkor nincs lehetősége a hiba javítására. A Taq-polimeráz optimális reakciókörülmények közötti működése során átlagosan egy szubsztitúciós mutáció történik 104 bázispáronként. A Mn2+, a Mg2+, a DNS-polimeráz és a dNTP koncentrációjának megnövelésével stabilizálni lehet a nem komplementer bázispárosodást, csökkenthető a bázispárosodás specificitása, így továbbá növelhető a rosszul anellálódott primer oligonukleotidról történő lánchosszabítás valószínűsége. Összességében a Taq-polimeráz mutációs gyakorisága elérheti ciklusszámonként a 0,066%-ot (30 ciklus során). A mutációk feldúsulását tovább növelhetjük a PCR során alkalmazott ismételt hígításos lépésekkel és a ciklusszám növelésével (60 ciklus; ld. 11.1. ábra). Ezzel a módszerrel összességében a felsokszorozandó DNS szekvenciájának akár a 3,5%-a is megváltozhat.

Az error prone PCR során deléciók és inszerciók is előfordulhatnak, jellemzően azonban szubsztitúciók történnek. A legtöbb polimeráz esetében nagyobb valószínűséggel történik A→G vagy T→C tranzíció (purin→purin, piridin→piridin), mint transzverzió (purin→piridin, purin→piridin). A négy dezoxiribonukleozid-trifoszfát arányának eltolásával és módosított Taq-polimeráz enzim (Mutazyme) használatával ez a mutációs aránytalanság (mutational bias) javítható. Az error prone PCR haszálatával létrehozott DNS inszert ezután megfelelő restrikciós enzimmel való emésztés után a kívánt plazmidba ligálható. A módszer hátránya, hogy a létrehozható variáns sereg méretét korlátozza a szubklónozási lépés során alkalmazott ligálás hatékonysága.

Hígításos módszer error-prone mutagenezis során

11.1. ábra: A hibát ejtő (error prone) PCR során alkalmazott hígításos módszer. A hibát ejtő (error prone) PCR mutagenezis során nem optimális körülmények között működő DNS-polimeráznak megnő a mutációs frekvenciája (ciklusszámonként a DNS 0,066%-a változhat meg). A ciklusszám növelésével növelhető a DNS-ben keletkező véletlenszerű mutációk száma. A hígításos módszer minden 4. ciklusa után a minta körülbelül 10%-át átoltják egy következő reakcióelegybe. Az átoltással frissítik a reakciót, így növelhető a ciklusszám egészen 60-ig. Összességében 60 ciklus után a DNS szekvenciájának akár 3,5%-a is megváltozhat.