11.2. Helyspecifikus in vitro mutagenezis módszerek

Clyde Hutchison és Marshall Edgell már 1971-ben felvetette a kis DNS fragmentekre épülő irányított mutagenezis ötletét (DNS kazetta mutagenezis, ld. 11.2. ábra). Hutchison és Michael Smith 1978-ban kifejlesztett egy általánosan használható, szintetikus oligonukleotidokra épülő módszert, mellyel mind inszerció, deléció és szubsztitúció is létrehozható. Az eredeti protokoll szerint a mutálandó DNS fragmentumot először FX174 fág DNS-be klónozták. A mutációt tartalmazó szintetikus oligonukleotidot ezután az egyszálú FX174 fág DNS-re anellálták, majd DNS polimeráz és ligáz használatával szintetizálták és cirkularizálták a mutációt tartalmazó új szálat. Az azóta kifejlesztett helyspecifikus in vitro mutagenezis módszerek mindegyike szintetikus oligonukleotidot használ a rekombináns fehérjék tetszőleges módosítására.

A szintetikus oligonukleotidok tervezésénél ajánlott, hogy az oligonukleotid a mutációtól mind 5’-, mind 3’-irányban is legalább 15 bázispárnyi szakaszon komplementer legyen a templát szállal és a 3’ végén lehetőleg G/C bázisokat tartalmazzon. A mutációtól 5’- és 3’-irányban található 15 bp általában elegendő a mutáció specifikus kijelölésére. A mutáció jelentheti egy bázispár megváltoztatását vagy az oligonukleotid „kihurkolódásával” érinthet akár egy nagyobb régiót is. Ezekkel a módszerekkel általunk szabályozott módon bármely pozícióban megváltoztatható a fehérjéket kódoló DNS szekvenciája. Az irányított mutagenezis során bármilyen „szabás-varrás” kivitelezhető; inszerció, deléció vagy szubsztitúció. Lehetőség van fehérjék vagy fehérjerészek fúziójára, kimérák létrehozására. is Az alábbiakban a legelterjedtebb és a leghatásosabb módszerek kerülnek bemutatásra.

11.2.1. DNS kazetta mutagenezis

Hutchison és Edgell által leírt DNS kazetta mutagenezis a legegyszerűbb és leghatékonyabb irányított helyspecifikus mutagenezis módszer (ld. 11.2. ábra). A mutálandó DNS fragmentumot egy dupla szálú plazmid tartalmazza. Két restrikciós endonukleáz emésztésével hasítjuk ki a mutálandó DNS szakasz környezetét, majd a megfelelő ragadós véggel rendelkező, mutációt tartalmazó szintetikus oligonukleotidokkal elkészített DNS kazettát T4 ligáz segítségével a plazmidba ligáljuk és E. coli baktériumba transzformáljuk. A DNS kazetta mutagenezis egy gyors, hatékony és könnyen kivitelezhető módszer. Fontos szempont, hogy a restrikciós enzim felismerőhelyek a mutálandó DNS szekvenciához közel helyezkedjenek el, így csak 60-80 bp hosszú DNS kazetta szintézise szükséges. Ilyen méretű oligonukleotid szintézise olcsó és gyors. Ha nagyobb méretű DNS kazetta szükséges (100-1000 bp), a szintézis költségei jelentősen megnövekednek. Ezekben az esetekben az alábbiakban is említett, rövid oligonukleotidokat igénylő módszerek költséghatékonyabbak.

DNS kazetta mutagenezis módszer

11.2. ábra: DNS kazetta mutagenezis módszer. A dupla szálú DNS plazmidot a mutálandó DNS szekvencia közvetlen környezetében restrikciós endonukleázzal emésztjük. A kieső DNS fragmentum helyére ligáljuk a mutációt tartalmazó szintetikus DNS kazettát.

11.2.2. Szelektív templát lebontáson alapú mutagenezis módszerek

A Smith és Hutchinson által kifejleszett irányított mutagenezis módszer (ld. 11.2. ) hatékonysága igen kicsi. Elméletben a mutációs ráta maximum 50%-os lehet, de a gyakorlatban a nem megfelelő oligonukleotid letapadás, a polimerizáció és a ligálás hiányos működése miatt a legjobb esetben is csak pár százalékot ér el. A módszer hatékonyságának növelése érdekében az újonnan létrejövő mutációt tartalmazó plazmid DNS-t szelektálni kell a vad típusú plazmid DNS-től.

11.2.2.1. Kunkel mutagenezis

A rekombináns fehérjék irányított mutagenezisének egyik legrégebbi, de néhány területen még a mai napig is használatos módszerét Thomas Kunkel 1985-ben közölte (ld. 11.3. ábra). A módszer nagy hatékonysággal képes általunk meghatározott pozícióban inszerciók, deléciók és pontmutációk létrehozására. A módszer alapja, hogy a mutálandó DNS inszertet egy M13 bakteriofág alapú egyszálú DNS fágmid tartalmazza. Erre, mint templátra, a mutációt tartalmazó oligonukleotidot anellálnak, majd T7 DNS-polimeráz használatával szintetizálják a már mutációt tartalmazó új szálat. A mutációt tartalmazó plazmid végül megfelelő baktérium törzsekben szelektálható.

Az első lépés a mutálandó DNS inszert M13-alapú fágmidba klónozása. Az inszertet tartalmazó fágmidból ezután egyszálú DNS-t hoznak létre, ami a mutagenezis során templátként fog szolgálni. A M13 fágmid vektor ötvözi a kétszálú DNS plazmidok és az egyszálú DNS fág tulajdonságait, amiről nevét is kapta (ld. bővebben a 7.3.2. fejezetben). E. coli sejtekben képes kétszálú DNS plazmidként szaporodni (ez az ún. replikatív forma). M13 helper fág hatására azonban egyszálú DNS másolatok jönnek létre, amelyek a helper fág által termelt M13 bakteriofág burokfehérjéibe csomagolódva M13 virionokat alakítanak ki. Az M13 bakteriofág egy nem-litikus bakteriofág, a kialakuló virionok a baktérium kultúra felülúszójába szekretálódnak, feldúsulnak, ahonnan könnyen tisztíthatók és belőlük egyszálú DNS izolálható.

Kunkel mutagenezis módszer sematikus ábrája

11.3. ábra: Kunkel mutagenezis módszer sematikus ábrája. A mutálandó DNS fragmentumot hordozó fágmidból egyszálú, uracil tartalmú DNS templátot állítunk elő dut-, ung- E. coli baktériumtörzsben. A mutációt tartalmazó, szintetikusan előállított oligonukleotidot a templát DNS-re anelláljuk, majd T7 DNS polimerázzal „körbeírjuk“ azt, végül az újonnan szintetizált szálat T4 ligázzal cirkularizáljuk. A duplex DNS-t dut+, ung+ E. coli baktériumtörzsbe transzformáljuk, melyekben a mutáns szál szelektálódik és a vad típusú szál lebomlik. A mutáns fágmid tovább szaporítható, belőle kétszálú vagy egyszálú DNS hozható létre.

Második lépésben az egyszálú templát DNS-hez a mutációt tartalmazó oligonukleotidot anellálnak. Egy mutációs lépésben akár több oligonukleotid is használható, így egymástól távolabb található DNS szakaszok egyszerre is megváltoztathatók. A következő lépésben T7 DNS-polimeráz használatával történik meg az egyszálú templát fágmid „körbeírása”, a kétszálú heteroduplex DNS létrehozása (az egyik szál az eredeti „vad típusú” templát, a másik szál a mutáns). A T7 DNS polimeráz egy processzív polimeráz, azaz képes hosszú, akár másodlagos szerkezettel rendelkező templát átírására is anélkül, hogy a templát szálról disszociálódna. Érdemes az oligonukleotidok 5’- és a 3’-végére lehetőleg G/C bázisokat tervezni, hogy elkerüljük a rossz helyre anellálást (mispriming) és ezáltal a nem-megfelelő termékek keletkezését. A 3’-végen található G/C bázispárok biztosítják a T7 DNS- polimeráz pontos működéséhez szükséges kezdő pozíciót. Az oligonukleotid 5’- végén található G/C bázispárok pedig megakadályozzák a T7 DNS polimeráz túlműködését, az oligonukleotid 5’ végének a templát DNS szálról való „letúrását”. Az újonnan szintetizált, már a mutációt tartalmazó DNS szálat T4 DNS-ligáz segítségével cirkularizálják. A T4 DNS-ligáz működéséhez szükséges a szintetikusan előállított oligonukleotid 5’ végének foszforilálása, amit az oligonukleotidnak a templát szálhoz való hozzáadása előtt polinukleotid-kináz enzimmel lehet elvégezni.

A kialakuló kétszálú heteroduplex DNS fágmidot E. coli sejtekbe transzformálják és így a továbbiakban plazmidként szaporítható. Smith módszeréhez hasonlóan az ilyen módon létrehozott fágmidoknak a legjobb esetben is csak az 50%-a fogja tartalmazni a mutációt. A Kunkel-módszer során ez az 50%-os mutációs ráta a templát DNS szál szelektív lebontásával csaknem 100%-ig eltolható. Ennek alapja, hogy a templátként szolgáló egyszálú fágmid timin helyett nagyrészt uracilt tartalmaz. Ezt úgy érik el, hogy az egyszálú DNS templátot olyan E. coli törzsben szaporítják, ami dUTP-áz és uracil N-glikozidáz deficiens (E. coli CJ236 K12 dut-, ung-, F pilus+). A dUTP-áz hiánya miatt a fágmid DNS szintézise során a sejtekben a dUTP koncentrációja megnövekszik és timin helyett gyakran uracil is beépül a DNS-be. Az uracil N-glikozidáz felelős a DNS-be már beépült uracil eltávolításáért, ezért az uracil N-glikoziláz deficiens törzs nem tudja kijavítani a DNS-be már beépült uracilt. A mutációt tartalmazó második szál T7 DNS-polimerázzal történő in vitro elkészítéséhez dUTP-t nem használnak fel, ezért az újonnan szintetizált szál uracilt nem tartalmaz. A következő lépésben a vad típusú, uracilt tartalmazó, és a mutáns, uracilt nem tartalmazó heteroduplex DNS-t vad típusú E. coli törzsbe (dut+, ung+) transzformálják (E. coli XL1-Blue vagy DH5-alpha). Az uracilt tartalmazó vad típusú DNS a dut+, ung+ E.coli sejtekben az uracil-N-glikoziláz enzim hatására preferenciálisan lebomlik, míg a mutáns változat jóval nagyobb arányban fennmarad, így növelve meg a mutációs rátát. A sejtekből a mutáns kétszálú fágmid plazmid tisztítható, illetve M13 helper fág használatával fág és egyszálú fágmid is termelhető.

A módszer előnye, hogy ha a mutálandó inszertet a továbbiakban is fágmid vektorban szeretnénk fenntartani, akkor ez nem igényel további klónozási lépéseket, mint például restrikciós endonukleázzal való emésztést vagy ligálást. Hátránya, hogy a fágmid vektoroknak korlátozott az alkalmazhatósága, így például ha a vizsgálandó rekombináns fehérjénket heterológ expresszióval E. coli baktériumban szeretnénk túltermeltetni, akkor a mutációt tartalmazó inszertet szubklónoznunk kell megfelelő expressziós vektorba (pl. pET). A heterológ expresszióról a 12. fejezetben találhatók további részletek.

11.2.2.2. QuickChange mutagenezis

A Stratagene cég által kifejlesztett „QuickChange” mutagenezis az irányított mutagenezis módszerek közül, mint neve is mutatja, talán a leghatékonyabb és leggyorsabb módszer (ld. 11.4. ábra). Deléció, inszerció és szubsztitúció is létrehozható vele. Előnye, hogy nem igényel speciális vektorrendszert, mint a Kunkel mutagenezisnél alkalmazott M13 fágmid, valamint összehasonlítva a PCR-alapú „megaprimer”, vagy az „overlapping” mutagenezis módszerekkel (ld. 11.2.3.1. és 11.2.3.2. ), nincs szükség további klónozó lépésekre (restrikciós emésztés, ligálás) sem.

A módszer során a mutálandó DNS fragmentumot bármilyen kétszálú plazmid tartalmazhatja. A kivitelezésnek előfeltétele, hogy a használni kívánt plazmid vektor guanin bázisai metiláltak legyenek. E feltétel teljesítése bármely géntechnológiában általánosan használt (dam+) E. coli törzs esetében teljesül, mint például az XL1-Blue vagy a DH5-alpha törzsek esetében (ld. 7. fejezet). A plazmidot vagy lúgos oldattal (NaOH kezeléssel), vagy hőkezeléssel denaturálják. A mutagenezishez olyan oligonukleotid primer párt használnak, melyek ugyanazon DNS-szakasz két szálához hibridizálnak és tartalmazzák a kívánt mutációt. A primerek tehát egymás komplementerei. Érdemes nagyon magas (Tm> 78°C) olvadási hőmérsékletű oligonukleotidot tervezni. Az olvadási hőmérsékletet megbecsülhetjük a következő egyszerű képlet használatával:

Tm = 81.5 + 0,41(GC%) - 675/N - mismatch%

ahol az N az oligonukleotid hossza, a GC% és a mismatch% egész számok. Egyszerre több primerpár használatával több, akár egymástól távolabbi DNS szakaszon is létrehozhatunk változást. A következő lépésben egy PCR során DNS-polimeráz (Pfu, KODI, Fusion/Phusion) használatával történik meg a mutációt tartalmazó új szálak szintézise.

A reakció végül vad típusú és mutációt tartalmazó plazmidokat és ezek heteroduplexeit eredményezi. A következő lépésben a reakcióterméket DpnI restrikciós endonukleázzal kezelik, ami képes magas sókoncentráció mellett (150-200 mM NaCl) specifikusan a metilált DNS lebontására, így a vad típusú templát plazmidok eliminálására (célszekvenciája: 5´-Gm6ATC-3´). A kezelés után a mutációt tartalmazó plazmidok intaktak maradnak. A DpnI enzimmel kezelt mintát, amely elvileg már csak a metilálatlan, mutáns plazmidokat tartalmazza, E. coli baktériumba transzformálják, ahol megtörténik a plazmid két végének ligálódása. A DpnI endonukleáz és a DNS-polimeráz minőségétől függően általában maximum 50%-ban sikeres a reakció. A mutáció hatékonysága 80-100%-ra növelhető, ha uracilt tartalmazó templátot használunk és a mutagenezis után a DNS termékünket dut+, ung+ E. coli baktérium sejtekbe transzformáljuk. Az uracil tartalmú templátot dUTP-áz és uracil N-glikoziláz deficiens E. coli baktérium sejtekben állíthatjuk elő (E. coli CJ236 K12 dut-, ung-, F pilus+).

QuickChange mutagenezis sematikus ábrája

11.4. ábra: QuickChange mutagenezis sematikus ábrája. A módszer során bármilyen, dam+ E. coli sejtben termelt kétszálú, metilált plazmid használható. A plazmidok hő- vagy lúgos denaturációja után mindkét szálra komplementer, a mutációt hordozó oligonukleotidot anellálnak. T7 polimeráz és T4 ligáz szintetizálja és cirkularizálja az újonnan képződő, a mutációt már hordozó szálat. A metilált, vad típusú DNS-t DpnI endonukleázzal magas sókoncentráció mellett specifikusan lebontják. A reakcióterméket mutS- E.coli sejtekbe transzformálják, melyekben a mutáns szál szelektálódik és szaporodik. Az ábrán a piros csillag a mutációt jelöli.

A „QuickChange” mutagenezis előnye a Kunkel-módszerrel szemben, hogy nem igényel speciális sejtvonalakat és vektorrendszereket. A PCR alapú módszerekkel szembeni előnye pedig, hogy nincs szükség további klónozási lépésekre. Hátránya, hogy az egész plazmid átírásra kerül, ezért nagyon jó minőségű, nagy hűségű DNS-polimerázt igényel. Nagyméretű plazmidok esetén (> 8 kbp) ezért speciális körülményeket és enzimeket kell használni (részletesebb leírást a gyártó cég honlapján itt olvashatnak).

11.2.2.3. GeneEditor mutagenezis

A Promega cég által kifejlesztett „szelekciós” oligonukleotidra épülő „GeneEditor” módszere a „QuickChange” mutagenezis egyik alternatívájaként szolgál. Minden általánosan használt ampicillin rezisztenciát (TME1 b-laktamáz) hordozó egyszálú és kétszálú plazmidban kódolt DNS fragmentum irányított megváltoztatására alkalmas (ld. 11.5. ábra). A mutáció során egyszerre két oligonukleotidot használnak fel. Az egyik magát a kívánt mutációt tartalmazza. Egyszerre egymástól távolabb található több mutáció is létrehozható több mutációs oligonukleotid együttes használatával. A másik típusú, az úgynevezett „antibakteriális szelekciós” oligonukleotid, a plazmidon kódolt ampicillin rezisztencia gént (TME1 b-laktamáz) módosítja. A módosított rezisztens plazmidot tartalmazó sejtek így nemcsak ampicillint tartalmazó táptalajon, hanem „GeneEditor™ Antibiotic Selection Mix”-et tartalmazó táptalajon is fenntarthatók. Első lépésben a plazmidot denaturálják, majd az oligonukleotidok anellálása után T4 DNS-polimeráz enzimmel és T4 DNS-ligáz enzimmel szintetizálják és cirkularizálják a mutációkat tartalmazó új szálat (mutáció a b-laktamázban és a vizsgálandó DNS inszertben). A ligáláshoz itt is szükséges az oligonukleotidok 5’ végének előzeteses foszforilálása. A mutagenezis terméket kompetens E. coli sejtekbe transzformálják, melyeket ampicillin és „GeneEditor™ Antibiotic Selection Mix”-et tartalmazó táptalajon növesztenek. Ezen a táptalajon csak azok a sejtek nőnek fel, melyek a kívánt, mutáns plazmidot tartalmazzák. A mutagenezis hatásfoka növelhető, ha a reakcióterméket E. coli BMH 71-18 mutS baktériumtörzsbe transzformálják. Az így elérhető mutációs ráta gyakran nagyobb, mint 90%.

A GeneEditor mutagenezis sematikus ábrája

11.5. ábra: A GeneEditor mutagenezis sematikus ábrája. A módszerrel TME1 b-laktamáz alapú ampicillin rezisztenciát hordozó plazmid által kódolt DNS inszert szekvenciáját lehet tetszőlegesen változtatni. A vektor hő- vagy lúgos denaturálása után oligonukleotidok használatával két parallel mutációt történik. Az egyik a vizsgálandó DNS inszerten, a másik a b-laktamázt kódoló génen. A szintézis (T4 DNS-polimeráz) és a cirkularizáció után (T4-ligáz) vad típusú és kétszeresen mutáns szálakat kapunk. A terméket E. coli mutS- baktériumtörzsbe transzformáljuk, majd „GeneEditorTM Antibiotic Selection Mix”-et tartalmazó táptalajon növesztjük, így csak a megváltoztatott b-laktamáz szekvenciát kódoló plazmidot tartalmazó sejtek szelektálódnak.

11.2.3. PCR alapú irányított mutagenezis módszerek

A polimeráz láncreakció egy tetszőleges DNS szekvencia hatékony és egyszerű felszaporítását teszi lehetővé (ld. 6. fejezet). A PCR-re alapozva az utóbbi évtizedekben számos irányított mutagenezis módszert fejlesztettek ki, melyek mindegyike több lépéses PCR-t és további klónozási lépéseket igényel. Mint minden klónozási lépés során, így a PCR alapú irányított mutagenezis módszerek esetében is általánosan ajánlott a „nagy hűségű”, azaz hibajavító aktivitással (high fidelity, proofreading) rendelkező DNS-polimerázok használata. Ilyen DNS-polimerázok például a Pfu-, KODI- vagy a Phusion-polimeráz (ld. 3.1.4 . fejezet)

11.2.3.1. Megaprimer PCR mutagenezis

A PCR alapú in vitro mutagenezis módszerek közül az 1990-es évek elején Sarkar és munkatársai által leírt „megaprimer” PCR módszer talán a leggyorsabb, legegyszerűbb és legsokoldalúbb (ld. 11.6. ábra).

„Megaprimer” PCR mutagenezis sematikus ábrája

11.6. ábra: „Megaprimer” PCR mutagenezis sematikus ábrája. A módszer során két egymást követő PCR segítségével irányítottan, bárhol létrehozható változás az vizsgált DNS szekvenciájában. Az 1. PCR lépésben a mutációt hordozó P2 és P3 oligonukleotidok használatával létrejövő termék az ún. „megaprimer”. A 2. PCR során a P1 primer és maga a „megaprimer” felhasználásával amplifikálódik a mutációt tartalmazó DNS szakaszunk, melyet a P1 és a P3 oligonukleotidok által kódolt restrikciós enzim felismerőhelyeken való emésztés után szubklónozhatunk.

A megaprimer módszer során három primer oligonukleotid és a vad típusú DNS templát felhasználásával két PCR történik. A három oligonukleotidból kettő, a határoló vagy „flanking” oligonukleotidok jelölik ki a felszaporítandó DNS szekvenciát és tartalmazzák a későbbi klónozáshoz szükséges restrikciós enzim felismerőhelyeket. A harmadik oligonukleotid tartalmazza magát a mutációt, ami lehet inszerció, deléció, szubsztitúció vagy ezek bármilyen keveréke. A mutáció a target génen belül bárhol létrehozható. Az első PCR során a mutációt hordozó oligonukleotid és az egyik határoló primer segítségével, valamint a vad típusú templát DNS felhasználásával előállítjuk a mutációt tartalmazó „megaprimert”. Az elkészült megaprimer mérete elérheti a több száz, vagy akár ezer bp hosszúságot is. A megaprimert agaróz gélelektroforézissel elválasztjuk az aspecifikus termékektől és a PCR során fel nem használt primerektől, majd gélből izoláljuk. A tisztított megaprimert, mint egy „általános” primert használjuk fel a másik határoló primerrel a második PCR során a már mutációt tartalmazó DNS szekvenciánk sokszorosítására. A második PCR során beállított anellálási hőmérsékletnél figyelemmel kell lenni a megaprimer extrém méretére és a másodlagos szerkezet kialakítására való hajlamára. Érdemes a primer párját úgy tervezni, hogy annak olvadási hőmérséklete 55-60°C környékén legyen. A második PCR során elkészülő mutáns DNS szekvenciának a mennyiségét a reakcióelegybe bemért megaprimer mennyisége fogja meghatározni, ezért ajánlott nagy mennyiségű megaprimer előállítása és a második PCR reakcióba a lehető legnagyobb mennyiségben való hozzáadása. A 2. PCR hozamát nagy mennyiségű templát használatával is növelni lehet. Az elkészült mutáns DNS termék agaróz gélelektroforézissel választható el az esetleg megmaradó megaprimertől és a templát DNS-t tartalmazó plazmidtól. A tisztított mutáns DNS inszertet a határoló oligonukleotidok által kialakított restrikciós enzim felismerőhelyeken emésztik és a megfelelően előkészített, restrikciós enzimekkel emésztett plazmidba ligálják. A ligátumot kompetens sejtekbe transzformálják, a mutáns DNS inszertet tartalmazó plazmidot szaporítják, majd a szekvenciáját szekvenálással ellenőrzik (a mutációt hordozó inszert plazmidba klónozásának folyamatáról további részletesebb leírás megtalálható a 4. fejezetben).

11.2.3.2. Overlapping PCR mutagenezis

A PCR alapú irányított mutagenezis módszerek közül az overlapping PCR mutagenezis használatával a vizsgálandó fehérje DNS-én belül bárhol létrehozható mutáció. A módszer a megaprimer PCR mutagenezis alternatívájaként használható. Hosszabb időigénye, az egymást követő három PCR és a négy primer miatt – szemben a „megaprimer” PCR során használt 3 primerrel – kevésbé terjedt el (ld. 11.7. ábra).

 

Az Overlapping PCR mutagenezis sematikus ábrája

11.7. ábra: Az Overlapping PCR mutagenezis sematikus ábrája. A módszer során két egymást követő PCR segítségével irányítottan, bárhol létrehozható változás a vizsgált DNS szekvenciájában. Az 1. PCR lépésben a mutációt kódoló, egymással átfedő köztes termékeket állítunk elő. A 2. PCR lépésben az átfedő DNS szálak kiegészítése történik. Végül egy mutációt tartalmazó, 5’ és 3’ végen restrikciós enzimfelismerő helyet kódoló inszertet kapunk, amelyet megfelelő plazmidba szubklónozhatunk.

Az első két PCR során két átfedő fragmentum jön létre, melyek tartalmazzák a mutációt és a klónozáshoz szükséges restrikciós enzim felismerőhelyeket. A következő PCR során ezen tisztított termékek anellálásából és lánchosszabbításából kialakuló, mutációt tartalmazó termék szolgál templátként a restrikciós enzim felismerőhelyét tartalmazó, a primer oligonukleotidok számára. A mutációt tartalmazó inszert megfelelő plazmidba klónozása a korábbiakban leírtak alapján történik (ld. 6.4.1.. fejezet).