12. fejezet - In vitro és prokarióta expressziós rendszerek

Tartalom

12.1. In vitro expressziós rendszerek
12.1.1. Az in vitro transzlációs rendszer komponensei
12.1.2. Előnyök és hátrányok
12.1.3. Alkalmazások
12.2. Prokarióta expressziós rendszerek
12.2.1. Bakteriális promóterek és a riboszóma kötőhely
12.2.2. A prokarióta fehérje expresszió optimalizálása
12.2.3. Fúziós rekombináns konstrukciók
12.2.4. Rekombináns fehérjék termelése és izolálása
12.2.5. A prokarióta expresszió előnyei, hátrányai
12.3. További olvasnivaló a fejezethez

A rekombináns DNS technológia egyik legfontosabb vívmánya, hogy a vizsgálataink tárgyát képező fehérjéket nagy mennyiségben, tisztán és viszonylag egyszerűen elő tudjuk állítani. A „tisztán” kifejezés itt nemcsak azt jelenti, hogy a preparátum kb. 90-95%-ban a bennünket érdeklő fehérjénket tartalmazza, hanem azt is, hogy például nem kell 1 mg neuronális fehérje előállításához 25-30 db patkányt megölni, mint a géntechnológiát megelőző korszakban. Az expressziós rendszerek felhasználásával a vizsgálandó fehérjét nemcsak egyszerűbben és nagyobb mennyiségben, hanem a céljainknak megfelelően módosítva - irányított mutációkkal, önálló doménként, csonkolt formában, különböző címkékkel (tag-ekkel) ellátva - is tudjuk termeltetni.

Nem mindegy, hogy milyen expressziós rendszert használunk. Ennek kiválasztásában jelentős szempont a szükséges fehérje mennyisége, tisztasága, poszttranszlációs módosítása, aktivitása, a ráfordított idő és pénz, illetve milyen infrastruktúra (és mennyi kutatási forrás) áll mögöttünk. Ebben a fejezetben a sejtmentes (in vitro expressziós rendszer) és a prokariótaexpressziós rendszereket ismertetjük. Megbeszéljük az alapjaikat, milyen vektorokat, gazdasejteket használhatunk, mik az előnyeik és hátrányaik, milyen célra melyik rendszert célszerű használni, valamint milyen alkalmazási lehetőségeik vannak. Az eukarióta expressziós rendszereket a következő fejezetben tárgyaljuk (ld. 13. fejezet)

Kezdjük az alapfeltételekkel, azaz mi az expressziós rendszerek két pillére? A gazdasejt, ami termeli a rekombináns fehérjét, illetve az expressziós konstrukció, azaz a rekombináns DNS, ami meghatározza a termelendő polipeptidlánc(ok) aminosav sorrendjét. A rekombináns fehérje kifejezés annyit jelent, hogy rekombináns DNS segítségével expresszáltatunk egy fehérjét, ami az esetek többségében megegyezik a natív fehérjével (azaz nem két polipeptidlánc „rekombinálásával” állítjuk elő). A fenti sémától eltér a sejtmentes, azaz in vitro expressziós rendszer, mivel ebben az esetben nincs szükségünk gazdasejtre, csak a pro- vagy eukarióta sejtből származó riboszómákra, valamint az in vitro transzkripcióhoz és transzlációhoz szükséges egyéb komponensekre.

A gazdasejt lehet baktérium (Escherichia coli, Bacilus subtilis), élesztő (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) vagy más eukarióta sejtvonal vagy akár transzgenikus állat és növény is. Ezek a gazdasejtek heterológ expresszióra képesek, vagyis arra, hogy nem a saját, hanem más fajból származó fehérjéket termeljenek. Mindegyik rendszernek vannak előnyei, és hátrányai, és megvannak a saját expressziós vektorai. Ezek az expressziós vektorok tartalmazzák azokat a szekvenciákat, amelyeket a gazdasejt felismer, és elindítja a kifejezendő gén transzkripcióját, majd transzlációját. A fejezetben támaszkodunk az 7. fejezet ismeretanyagára.

12.1. In vitro expressziós rendszerek

Az in vitro vagy sejtmentes expresszió azon alapszik, hogy in vitro körülmények között a sejtből kivont transzlációs rendszer segítségével szintetizáltatjuk a kívánt fehérjét. (A sejtmembránt, illetve eukarióta sejteknél az organellumokat is eltávolítva, a citoplazma és a benne található komponensek alkotják a „sejtmentes” rendszert). A rendszer működéséhez szükség van a genetikai információra, azaz a kívánt fehérjét kódoló mRNS-re, illetve általában egy expressziós vektorban lévő rekombináns DNS-re, valamint a reakció oldatra, mely tartalmazza a szükséges transzkripciós és transzlációs aktivitást. A legelső sejtmentes transzlációs rendszer prokarióta kivonat volt, ezt követték az eukarióta sejtmentes transzlációs rendszerek, rovarsejt (Sf9, Sf21-sejt), nyúl retikulocita (RRL), búzacsíra, és ma már humán sejtvonalból származó transzlációs rendszer is elérhető. További információ a kereskedelmi forgalomban elérhető rendszerekről itt olvasható.

12.1.1. Az in vitro transzlációs rendszer komponensei

Mi szükséges a sikeres in vitro transzlációhoz?

  • RNS-polimeráz és NTP-k az mRNS transzkripciójához

  • riboszómák a polipeptidlánc transzlációjához

  • tRNS-ek és aminosavak

  • transzlációs kofaktorok

  • ATP, GTP és energiaregeneráló rendszer

  • dajkafehérjék és más faktorok a polipeptidlánc feltekeredéséhez

  • templát nukleinsav

A fehérje-komplexeket és faktorokat a kereskedelmi forgalomban kapható sejtmentes kivonatok tartalmazzák, csak energiaforrást (ATP, GTP, energiaregeneráló rendszert) és aminosavakat kell hozzáadni, valamint értelemszerűen a templát nukleinsavat.

A templát nukleinsav mRNS vagy DNS lehet. Amennyiben a templát DNS, azt először át kell írni mRNS-sé, és majd az azt követő transzlációs reakció során lesz belőle fehérje. Ezért ezt a rendszert kapcsolt (linked vagy coupled) rendszernek hívják (ld. 12.1. ábra).

A kapcsolt rendszer esetén ugyanabban a csőben játszódik le egymás után a transzkripció és transzláció. DNS templát esetén a bemenő DNS lehet lineáris, cirkuláris, vagy PCR termék. A DNS-nek tartalmaznia kell a transzkripció és transzláció elindításáért felelős elemeket, tehát a promóter szekvenciát, és prokarióta rendszernél a riboszóma kötőhelyet (RBS), azaz a Shine-Dalgarno szekvenciát. Eukarióta rendszernél ennél bonyolultabb a helyzet, mert a splicing folyamatát (DNS templát esetén), továbbá az mRNS érését és transzlációjának iniciálását is nekünk kell megoldani. Ezért a megfelelő génexpressziós elemeket (pl. Kozak-szekvencia, IRES) is tartalmaznia kell a templátnak, illetve intron mentes DNS-t kell bejuttatni a rendszerbe. Ennek megfelelően speciális prokarióta vagy eukarióta expressziós vektorokba kell a target gén cDNS-t bevinni. Ezek az expressziós vektorok expressziós kazettájukban már eleve tartalmazzák a génexpresszióhoz szükséges elemeket (ld. 12.2. ábra).

12.1. ábra: A kapcsolt (linked vagy coupled) in vitro transzlációs rendszer sémája

Prokarióta expressziós kazetta sematikus ábrája

12.2. ábra: Prokarióta expressziós kazetta sematikus ábrája. T7P: T7-promóter szekvenciája, RBS: riboszóma kötőhely szekvenciája, ATG: az első metionin aminosav kodonja, Tag: fúziós címke (a példában C-terminális) szekvenciája, T7T: T7 transzkripció terminációs szekvencia

Ilyen vektorok, illetve in vitro transzlációs kit-ek megvásárolhatók, pl. a NEB (New England Biolabs), Invitrogen vagy a ThermoScientific biotechnológiai cégektől. Mivel lineáris DNS-t is használhatunk templátként, ezért PCR reakcióval mi magunk is elkészíthetjük a templátunkat. Ilyenkor olyan primerekkel kell felszaporítani a cDNS-t, amely tartalmazza a megfelelő szabályozó elemeket. A 12.2. ábra alapján látható, hogy az 5' primernek tartalmaznia kell a promótert az RBS-sel együtt, a 3'-primernek pedig a terminációs szekvenciát. Azaz a használandó primerek sematikus felépítése:

  • 5'-primer: T7P szekvencia-RBS szekvencia-cDNS-re illeszkedő szekvencia.

  • 3'-primer: cDNS-re illeszkedő szekvencia-T7T szekvencia (természetesen ennek a reverz komplementere kell).

A Roche cég fejlesztése, a Rapid Translation System (RTS 500), E. coli extraktumot használ, amely akár egy napig is képes folyamatos szintézisre, így nagyobb mennyiségű fehérjét tud előállítani. Ezt úgy tudták megoldani, hogy gondoskodtak az energia hosszú távú regenerálásáról, illetve a kofaktorok, alapanyagok (nukleotidok, aminosavak) folyamatos betáplálásáról és a gátlóanyagok elvezetéséről. Ezt úgy oldották meg, hogy féligáteresztő hártyával elválasztják a reakciótértől a keletkező gátló anyagokat, ami a konvencionális módszer egyik legnagyobb problémája. A rendszerről további információ itt olvasható.

12.1.2. Előnyök és hátrányok

Előnyök:

  • A leggyorsabb expressziós rendszer, néhány órát vesz csak igénybe.

  • Egyszerű, nem igényel sejttenyésztést, transzformálást, intenzív fehérjetisztítást.

  • Független a gazdasejttől (nincs gazdasejt).

  • Toxikus fehérjékre is használható (nincs sejt, ami elpusztulna).

  • Proteolízisre nagyon érzékeny fehérjék expressziója is megoldható (bár a sejtmentes kivonathoz is szüksége lehet proteáz enzim gátlószerek hozzáadására).

Hátrányok:

  • Kevés fehérje állítható elő, általában egy reakcióval 0,1 μg/ml fehérjét nyerhetünk ki. Gyakran ki sem tisztítjuk a fehérjét, hanem a fehérjét tartalmazó reakcióoldattal dolgozunk tovább.

  • Nem megfelelő a poszttranszlációs módosítás (glikoziláció, foszforiláció), bár ez a probléma megfelelő in vitro transzlációs rendszer megválasztásával megoldható: pl. humán fehérjét humán sejtvonalból nyert sejt extraktummal szintetizáltathatunk.

  • A sejtkivonat endogén mRNS-étől meg kell szabadulni (kezelés micrococcus nukleázokkal).

12.1.3. Alkalmazások

  • Gyors és nagyszámú mutáns vagy csonkolt fehérjék előállítására funkcionális analízis céljából (nagy áteresztőképességű, ún. high throughput, HTP módszer)

  • Megfelelő poszttranszlációs modifikációval rendelkező humán fehérjék előállítására.

  • Fehérjék stabil izotópos jelölésére, nem-természetes aminosavak bevitelére, mivel a reakcióhoz szabadon hozzáadhatók a jelölt vagy nem természetes aminosavak.

  • Funkcionális virionok (vírusfehérjék és nukleinsavak, amelyek spontán virionná állnak szerveződnek), illetve toxikus polipeptidek előállítására.

  • Adott fehérje feltekeredésének (folding), stabilitásának és degradációjának tanulmányozására és optimalizálására.