12.2. Prokarióta expressziós rendszerek

Nézzük meg a prokarióta expressziós vektorok általános felépítését, amelynek alapelemei a riboszóma kötőhely kivételével az eukarióta expressziós vektorokban is megtalálhatóak (ld. 12.3. ábra).

Korábbi fejezetekben már ismertettük a vektorok és ezen belül plazmidok általános felépítését (ld. 7. fejezet), ezért ebben a fejezetben csak a génexpresszió szempontjából legérdekesebb elemekről, a promóterekről, és a riboszóma kötőhelyről (RBS) lesz szó.

12.3. ábra: Egy tipikus prokarióta expressziós vektor felépítése

12.2.1. Bakteriális promóterek és a riboszóma kötőhely

12.2.1.1. Promóterek

A bakteriális expressziós vektorok általában plazmid-alapúak, amelyek legtöbbször indukálható promótert tartalmaznak. Már korábban megtanultuk, hogy a prokarióta promóternek két fontos eleme van: a Pribnow-box vagy -10 elem (TAAATA konszenzus szekvencia), ami 10 bp-ra található 5’-irányban az első átírandó bp-hoz képest (amely a +1 pozíciót jelenti). Ezen elem jelenléte esszenciális a transzkripcióhoz. A másik elem egy TTGACA konszenzus szekvencia, amit -35 szekvenciának is hívunk, mert a start ponttól 35 bp-ra található upstream, azaz 5’-irányban az átíródó szekvenciától. Jelenléte a promóterben nem esszenciális, de jelentős mértékben hozzájárul a gén átírásához. Végül sok prokarióta promóterben a -35 elemtől 5’-irányban további nem esszenciális szekvenciák is találhatók („UP” elemek). Egy tipikus bakteriális promóter fő elemeit a 12.4. ábra mutatja be.

12.4. ábra: Egy bakteriális promóter sémája

A bakteriális promóterek lehetnek állandó kifejeződést biztosító, azaz konstitutív, vagy indukálható promóterek. Az indukció történhet hőmérséklettel, vagy valamilyen kémiai ágenssel, induktorral. Az indukció leggyakrabban IPTG-vel (izopropil-tiogalaktozid) történik, ami egy nem metabolizálódó laktóz analóg. Így az indukció a lac-operon szabályozási elvén alapul, azaz az expressziós vektor a promóter mellett tartalmazza a lac operátor szekvenciát is (a -10 elem és az átíródó szekvencia között). Az induktor (allolaktóz vagy IPTG) hiányában a lac-represszor fehérje kötődik ehhez a szekvenciához, így nem hozzáférhető az RNS-polimeráz számára a promóter, tehát nincs mRNS átírás. Allolaktóz vagy IPTG jelenlétében a lac-represszor leválik a promóterről, megtörténik a génátírás. Ráadásul, az IPTG mennyiségével még az átírás mértékét is szabályozni tudjuk.

Lac promóter (lavUV5 promóter): Általánosan elterjedt, ilyen van a pUC katabolit, pTZ, pSK, pBluescript, pGEM vektorokban. Bár a promóter viszonylag gyenge, mégis megfelelő mértékű fehérje kifejeződés érhető el, mivel a plazmid nagy kópiaszámú. Akkor működik a promóter maximálisan, ha a baktérium kultúra médiuma nem tartalmaz glükózt, ugyanis ekkor működik a cAMP/ aktivátor fehérje (CAP), ami szükséges a promóter működéséhez.

Trp-lac (tac) promóter: hibrid promóter, -35 régió tartalmazza a trp (trp operon) -35 szekvenciáját, majd -10-nél a lavUV5 promoter (lac-operon) szekvenciáját és a lac-operátor szekvenciáját. Így a promóter regulálható a lac-represszorral, azaz a génátírás indukálható IPTG-vel, és független a cAMP regulációtól. Erős promóter, nagymértékű expresszió érhető el vele. Ilyen promóter található a pGEX vektorokban, amelyek sematikus felépítését a 12.5. ábra mutatja be.

12.5. ábra: A pGEX-3X expressziós vektor térképe

A pGEX vektorok replikonja (pMB1) a pBR322 vektorból származik, ezért ezek alacsony kópiaszámú vektorok. Általában ampicillin rezisztenciájuk van, amit a b-laktamáz enzim, a rezisztencia gén terméke biztosít. A trp promóterrel való hibridizáció miatt sokkal erősebb indukálható expressziót biztosít, mint a lac promóter, 3-szor erősebb a trp, és 10-szer a lac-promoternél. Ez egy GST-fúziós fehérje termeltetésére alkalmas vektor (ld.12.2.3.1. fejezet)

Trp-lac (trc) promóter: szintén hibrid promóter, a tac promóter egyik változata. A különbség a két promóter között a -35 és -10 elemeket elválasztó távolságban van, a trc-promóternél rövidebb. Ilyen promóter található a pTrc vektorokban.

T7 promóter: A legerősebb promóterek közé tartozik. A T7 bakteriofág specifikus promótere, 5-ször erősebb, mint az E. coli baktérium konszenzus promótere, ezért nagymértékű expressziót biztosít. Speciális baktériumtörzs kell hozzá, amely képes felismerni a T7 promótert, azaz termeli a T7 RNS-polimeráz enzimet (az E. coli RNS-polimeráz enzim csak a saját génjei promótereihez kötődik, miként a T7 bakteriofág RNS-polimeráz csak a fág gének promótereihez kötődik). Ezért az E. coli BL21 baktériumtörzs genomjába fág-fertőzéssel bejuttatták a T7 fág RNS-polimeráz génjét úgy, hogy a lacUV5 promóter szabályozása alatt legyen. Az így kapott baktériumtörzset hívjuk BL21(DE3)-nak. A DE3 profág egy λ-fág származék, amelynek - a kromoszomális integrációért felelős -int génjébe juttatták be a T7 RNS-polimeráz és a lacI represszor fehérje géneket. Ebben a törzsben a laktóz analóg IPTG hatására beindul a T7 RNS-polimeráz termelése, ami felismeri a plazmidon lévő T7-promótert, és elkezdi átírni a promóter után lévő inszertet.

Ilyen promóter található a pET vektorokban (plasmid for Expression of T7 RNA polymerase) (eredetileg a Novagen biotechnológiai cég terméke), amelyet Studier és társai fejlesztettek ki a ’90-es évek elején. Ezek a vektorok colE1 origót (replikon) tartalmaznak, ami alacsony kópiaszámot biztosít, és általában ampicillin vagy kanamicin rezisztencia gént hordoznak. A promóterük vagy a T7 fág természetes promótere, a φ10 promóter, vagy a természetes φ10 promóter a lac operátorral (LacO) együtt. Az így kapott T7lac promóter már indukálható IPTG-vel, és nagyobb biztonságot jelent, mert mind a polimeráz, mind a termelendő fehérje génje a lac operátor szabályozása alatt áll, és IPTG-vel indukálható. Tehát indukció nélkül elméletileg nincs génátírás. De a BL21 pLysS és pLysE baktériumtörzsekben még egy extra biztosíték is van; ezek a törzsek külön plazmidon (pLys) hordozzák a T7 RNS-polimeráz természetes inhibitorának, a lizozimnek a génjét. IPTG nélkül, az esetleg keletkező RNS-polimerázt a lizozim gátolja, így biztos nincs átírás. Ezt akkor érdemes kihasználni, ha toxikus a fehérje a baktérium számára, így csak az indukció hatására kezd a fehérje expresszálódni. Nézzük meg a 12.6. ábrán az igen gyakran használt pET-expressziós rendszer működését. Itt találhatók további elméleti és gyakorlati részletek a legmegfelelőbb vektorok kiválasztásáról.

12.6. ábra: A pET-expressziós rendszer sémája

λpL promóter: Magas hőmérséklettel indukálható, mert hőmérséklet érzékeny represszort tartalmaz. A λ-fág represszor fehérje alacsony hőmérsékleten a promóterhez kötődik, míg magasabb hőmérsékleten leválik, így elkezdődhet a génátírás. A baktérium kultúrát 30°C-on növesztjük, majd az indukció 42°C-on történik. Ez a promóter különösen hasznos toxikus fehérjék kifejeztetésénél. Ilyen vektorok a pHUB, pPLc, pKC30, pAS1, pRM1, pTrxFus sorozatok. De ehhez a promóterhez is speciális E. coli törzsre van szükség: az M5219 törzs a l-represszor gén hőmérséklet érzékeny mutációját hordozza.

araBAD promóter: Az arabinóz operon operátor helyét tartalmazza, így arabinózzal indukálható, dózis-függő módon. A promóter, mivel arabinóz hasznosítású operon része, glükózzal gátolható. Ilyen promóterrel a pBAD sorozat (Invitrogen) vektorai működnek.

lpp promóter: Az expressziós vektor a kifejezendő gén előtt egy külső membrán lipoprotein promóterét tartalmazza. Ez a fehérje nagy mennyiségben és állandóan kifejeződik a baktérium sejtben, így a promóter erős és konstitutív lesz.

phoA promóter: A bakteriális alkalikus foszfatáz gén (phoa) promóterét és N-terminális leader szekvenciáját tartalmazza. Így a fehérjénk olyan N-terminális szekvenciával fog kifejeződni, ami a periplazmatikus térbe küldi. A promótert lehet indukálni foszfát megvonással, vagy akár éheztetéssel. Ilyen promóter található a pTA vagy pBAce vektorokban.

rrnB promóter: Magyar vonatkozású promóter; Venetiáner Pál akadémikus és munkatársai (MTA SZBK, Szeged) fejlesztették ki. Azon alapul, hogy a transzkripció mértékéhez nagyban hozzájárulnak a promóterhez képest upstream irányban lévő szekvenciák is. Ezért az 5S rRNS gén promóteréhez, ami magában is egy nagyon erős promóter, még egy extra 5’-szekvenciát adtak -40-60 régióban. Ez az upstream szekvencia (UP promóter modul) az RNS-polimeráz a-alegység C-terminális részének kötőhelyét tartalmazza, így értelemszerűen megnöveli a génátírás hatékonyságát (kb. 30-szorosára).

12.2.1.2. Riboszóma kötőhely (RBS)

Az RBS vagy Shine-Dalgarno szekvencia (amely az átírt mRNS 5’-UTR, azaz nem transzlálódó régiójában található) is nagyon fontos a gének kifejeződéséhez. Ez az 5-9 nukleotidból álló szekvencia komplementer a 16S rRNS 3’ régiójával, így segíti a riboszóma kötést és a transzláció iniciálását. Az RBS és a transzlációt iniciáló ATG (start) kodon távolsága 3-11 nukleotid, s szintén jelentősen befolyásolja az expresszió mértékét (azaz a távolság változtatásával is optimalizálni lehet a fehérjetermelés szintjét – ld. később). Az expresszió hatékonyságát a RBS-től még távolabb lévő 5’-nem kódoló régiók is befolyásolják és a gén 3’-végén található transzkripcióterminciós szekvenciák is növelhetik (bár nem esszenciálisak a legtöbb rekombináns fehérje előállításához).

A kereskedelemben kapható expressziós vektorok tartalmazzák a megfelelő szabályozó elemeket. Nekünk csak arra kell ügyelnünk, hogy az expresszálandó génünket a megfelelő helyre klónozzuk be; a promóter és a riboszóma kötőhely után, ne vágjuk ki a riboszóma-kötőhelyet, és a leolvasási keret se tolódjon el. A START kodont tartalmazhatja a vektor szekvencia (pl. az NdeI restrikciós enzim felismerőhelyében van egy START kodon: ATGCAT), de a cDNS-sel is bevihetjük a vektorba, csak az RBS-hez való távolságára kell ügyelni. A promóter és ariboszóma-kötőhely létfontosságúak a gének expessziójához, a szabályozó elem (operátor régió) nélkül ugyan működhet az expressziós rendszer, de mégis ajánlott erre is gondolnunk, főleg az expresszió optimalizálásához (ld. alább). A kiválasztott expressziós rendszer vektorai tartalmazzák ezeket az elemeket. Azt kell még meggondolnunk, hogy a kívánt fehérje utolsó aminosava után szeretnénk-e befejezni a fehérje szintézisét, vagy fúziós címkét akarunk a fehérje C-terminális részére. Első esetben STOP kodont kell tennünk a cDNS végére (természetesen használhatjuk a gén saját STOP szekvenciáját is), a második esetben ki kell ezt hagyni. Ezután csak az MCS (multiklónozó hely) megfelelő helyére kell bevinnünk az expresszálandó gén cDNS-ét. Az így elkészített vektort be kell juttatnunk a megfelelő gazdasejtbe (ld. 4.3. fejezet).

12.2.2. A prokarióta fehérje expresszió optimalizálása

Feltételezzük, hogy sikerült kiválasztanunk a megfelelő prokarióta expressziós vektort és a vele kompatibilis baktérium törzset. Az inszertünk (a kívánt fehérje cDNS-e) megfelelő helyre bekerült az expressziós vektorba. Sikerült a plazmid transzformálása az expressziós törzsbe, a transzformált baktériumok jól osztódnak. Az indukciót is jól elvégeztük, de vagy nincs termékünk, vagy nem megfelelő a mérete, vagy nem elegendő a mennyisége. Mi lehet a gond, mi a teendő?

  1. Nézzük újra át a vektor térképét, nem klónozó vektort használunk-e, ami nem tartalmaz riboszóma kötőhelyet! Megfelelő leolvasási keretben (frame-ben) van-e az inszert. Ez különösen az N-terminális fúziós címkét tartalmazó konstrukcióknál fontos (ld. 12.2.3. ). A hárommal nem osztható számú hasítóhelyekkel óvatosan kell bánni (ilyen pl. a NotI), mivel ezek könnyen eltolhatják a leolvasási keretet.

  2. Szekvenáljuk a plazmidban lévő inszertet! Nincs-e benne deléció, inszerció, ami frame eltolást vagy STOP-kodon beépülést okoz. A plazmid promótere és a transzkripciós terminációs szekvencia kiváló primerül szolgál a szekvenáláshoz. Ez a pET-plazmidoknál maga a T7-promóter (T7forward), vagy a T7Term (T7Term-reverse).

  3. Kövessük nyomon a fehérjénk sorsát! Vegyünk mintát minden lépésnél, futassuk meg a mintákat SDS-poliakrilamid gélelekroforézissel (SDS-PAGE) és festéssel, vagy Western-blottal ellenőrizzük a kapott terméket. Legyen mintánk az indukálatlan sejtekből, majd az indukció után is a sejtekből, a sejt feltárása és centrifugálása után a felülúszóból és a pelletből (csapadék, ami a centrifugacső alján összegyűlt), majd az összes tisztítási lépés után is. (A fehérjék tisztítását ld. 12.2.4. fejezet.)

  4. Van fehérjénk, csak sajnos nem az oldható frakcióban, ami a sejt lizátum felülúszója, hanem a csapadékban. Ez azt jelenti, hogy a fehérjénk oldhatatlan formában van a zárvány testben (más néven inklúziós test). Ekkor két lehetőség áll előttünk: az inklúziós testből preparáljuk tovább a rekombináns fehérjét minden hátrányával és előnyével együtt, vagy megpróbáljuk eltolni a fehérje termelést az oldható forma irányába.

  5. Nagyon kevés fehérjénk van. Miért nem expresszálódik a fehérje?

    • Próbáljuk optimalizálni az indukciós körülményeket; hőmérséklet, idő, indukciós ágens koncentrációja.

    • Korai terminálódás, mert ritka kodonok vannak az inszertben közel egymáshoz (olyanok, amelyekre nincs elég antikodont hordozó tRNS a gazdasejtben) - pl. humán fehérjét szeretnénk expresszáltatni prokariótában, ahol más bizonyos aminosavak kodon preferenciája. Használjunk olyan baktérium törzset, amely ritka kodonokat is használ (pl. Rosetta, a Novagen cégtől, vagy CodonPlus, a Stratagene cégtől). Emlékezzünk, fajonként más és más a kódszótár kodon használati gyakorisága! Az E. coli és a humán kódszótárak kodon gyakoriságát a következő táblázatban hasonlítjuk össze. Sárgával emeltük ki az E. coli által használt ritka kodonokat (ld. 12.1. táblázat)

      12.1. táblázat: Az E. coli és a Homo sapiens kódszótár összehasonlítása

    • Rövid az mRNS életideje, használjunk olyan törzset, amelyben bizonyos RN-ázok hiányoznak. (pl. BL21Star)

    • Nem elég stabil a fehérjénk és degradálódik a tisztítás során. Használjunk proteáz gátlószereket, tárjuk fel a sejteket óvatosabban, és tartsuk minden tisztítási lépésnél a preparátumot jégen, vagy 4°C-on.

    • Fejeztessük ki a fehérjénket expressziót és oldhatóságot segítő N-terminális címkékkel, ilyen pl. a GST illetve MBP címke (ld. 12.2.3. ).

    • Gondoljuk meg, hátha elég a céljainknak a fehérje kisebb része, N- vagy C-terminális csonkolt része, fragmentuma. Expresszáltassuk a feltehetően rendezetlen N- vagy C-terminális részeket kódoló régió nélküli fehérjét. A fragmentumot kódoló templát DNS-t szubklónozással, in vitro mutagenezissel, PCR módszerrel állíthatjuk elő.

    • Toxikus lehet a fehérjénk a gazdasejt számára, ezért használjunk olyan rendszert, amelyben nagyon szigorú szabályozás alatt van a promóter. Ilyenek a pLysS és pLysE plazmidot tartalmazó törzsek.

    • Próbáljunk ki más promóterrel rendelkező expressziós vektorokat, más baktérium törzseket.

    • Használjunk másik táptalajt a baktérium kultúra növesztéséhez. Általában LB táptalajban fejeztetjük ki a fehérjét, de válthatunk YT, 2YT, Terrific Broth, NzCYM, Nzamin tápra is. Változtathatjuk a táptalaj NaCl koncentrációját is: 0,2-0,6 M között. Adjunk a növesztéshez glükózt (vigyázat, mert lac-operátort tartalmazó vektoroknál ekkor meg kell növelni az IPTG koncentrációját!), vagy más cukrot

    • Fejeztessünk ki bakteriális dajkafehérjéket (chaperonokokat) a fehérjénkkel együtt a hatékonyabb folding érdekében. Például a DnaK-DnaJ chaperonokat vagy a GroEL-GroES chaperoninokat hordozó expressziós vektorokkal együtt expresszáltassuk a fehérjénket (ld. 12.2.2.4. ). Elképzelhető, hogy a fehérjénket csak a kölcsönható partnerével együtt lehet expresszáltatni – ezt is érdemes kipróbálni.

    • Váltsunk expressziós rendszert, pl. eukarióta expressziós rendszerre térjünk át (ld. 13. fejezet).

Ne felejtsük el, hogy a rekombináns fehérjék expressziója, bár vannak általános elvek, mégis a tapasztalaton alapul. Kísérletezni kell, hogy melyik körülmény, forma a legoptimálisabb az adott fehérje és az adott konstrukció előállításához.

12.2.2.1. Az indukciós körülmények optimalizálása

Az indukciós körülmények optimalizálása az expressziós idő, a hőmérséklet és az induktor koncentrációjának a változtatását jelenti, miközben monitorozzuk az expresszálódott fehérje mennyiségét mind a sejtlizátum oldhatatlan (centrifugálás utáni csapadék), mind az oldható frakciójában (felülúszó). Az expresszált fehérje mennyiségét nyomon követhetjük SDS-PAGE-val, vagy Western blottal. A Western blot előnye, hogy a specifikus ellenanyag megmondja, melyik „csík” felel meg a gélen a fehérjénknek. Ez akkor különösen nagy segítség, ha nem vagyunk biztosak a fehérje elektroforetikus mobilitásában, vagy kevés a mennyisége. Használhatunk a fehérjénkre, vagy a fúziós címkére specifikus ellenanyagot (anti-His, anti-GST, anti-MBP, anti-Flag, anti-HA). Ez a kísérlet arra a kérdésre is választ ad, hogy termelődik-e (nem történt-e korai termináció) és mennyire stabil (degradálódik-e) a fehérjénk.

Hogyan függ a vizsgált három paramétertől az expresszió mennyisége, sebessége? Minél magasabb a hőmérséklet, és nagyobb az induktor koncentrációja, annál gyorsabban fejeződik ki a fehérje. Ez olyan gyors lehet, hogy a fehérje megfelelő feltekeredésére, harmadlagos szerkezetének felvételére nem lesz idő, így a fehérje belső hidrofób magjai kívülre kerülnek, s ezen keresztül a fehérjék összetapadnak, aggregátumokat képeznek és oldhatatlan formában kicsapódnak. Ezt általában el kell kerülnünk, mert nehéz a fehérjét visszaoldani, illetve renaturálni úgy, hogy visszanyerje a biológiai aktivitását (kivéve, ha eleve zárványtestből szeretnénk preparálni). IPTG-vel történő indukció esetén, ami a legelterjedtebb indukciós módszer, általában 0,01-1 mM között változtatjuk az IPTG koncentrációját. A hőmérséklet hatása is könnyen értelmezhető, hiszen minél magasabb hőmérsékleten történik az indukció, annál gyorsabban megy végbe minden folyamat, így a transzkripció és a transzláció is a sejtben. Általában 15-37°C között történik az expresszió. Az optimális hőmérséklet mellett érdemes beállítani az induktor koncentrációját és az expresszió idejét is. Minél hosszabb ideig indukálunk, annál több fehérje keletkezik, ami növeli az esélyét annak, hogy oldhatatlan fehérjét kapunk. Szisztematikusan meg kell nézni a fehérje mennyiségét a paraméterek változtatásával mind az oldható, mind az oldhatatlan frakcióban.

12.2.2.2. Expressziós törzsek (BL21pLysS, BL21pLysE, Rosetta, BL21Star, stb.)

Sokszor segítséget jelent, ha más törzsben fejeztetjük ki a fehérjénket. Ha például arra gyanakszunk, hogy korai termináció miatt leválik a riboszómáról a mRNS, ezért nincs megfelelő méretű termékünk az expresszió során. Ha a fehérjénk cDNS-ének bioinformatikai vizsgálata is azt mutathatja, hogy több ritka kodon van egymás után, amin nem áll módunkban módosítani, akkor érdemes olyan gazdatörzset használnunk, amely tartalmaz ritka kodonú tRNS-eket. Ilyen a BL21 származék Rosetta törzs (Novagene). Ha rövid az mRNS életideje a sejtben, akkor fejeztessük ki a fehérjénket BL21(DE3)Star sejtekben. Ennek a törzsnek a fenotípusa: F– ompT hsdSB(rB–, mB–) gal dcm rne131 (DE3). Ebből látszik, hogy alkalmas IPTG indukálta génexpresszióra T7-promóteren keresztül, az ompT- és lon- proteázok inaktívak (defektesek), ami fontos, hogy ne degradálódjon a rekombináns fehérjénk. A fenti tulajdonságok a BL21(DE3) sejtekben is megtalálható, de a Star-nál még a rne131 jelzés is szerepel, ami azt jelenti, hogy az RNáz-E gén csonkolt, ezért inaktív. Így megnő a sejtben a mRNS stabilitása, életideje.

Ha toxikus a fehérjénk (pl. aktív protein-kinázt, foszfatázt, proteázt fejeztetünk ki), használjunk pLysS törzset, így csak az indukció megkezdésével expresszálódik a fehérje, addig zavartalanul szaporodhatnak a sejtek. A rekombináns fehérjék előállításoz használatos törzsekről kitűnő összefoglaló olvasható itt. Az említett törzsek genotípusáról pedig ezen az oldalon talál az olvasó további részleteket.

12.2.2.3. Promóter optimalizálás

Amennyiben mindent kipróbáltuk, de még így sem expresszálódik megfelelően a fehérje, akkor érdemes más promóterrel is próbálkozni. Ez azt jelenti, hogy más promótert tartalmazó expressziós plazmidba kell az inszertünket szubklónozni. Lehet, hogy a T7lac promóter olyan mértékű expressziót eredményez, ami összes fehérjénket zárványtestbe viszi. Ilyenkor megoldást jelenthet a gyengébb tac vagy lac promóter használata. Ne felejtsük el, a promóterek csak a nekik megfelelő expressziós törzsben működnek. Például a T7 promóter nem működőképes, ha nincs a baktériumban T7 RNS-polimeráz, ezért ehhez a promóterhez módosított BL21 törzset kell használnunk, mint a BL21(DE3) vagy a HMS174(DE3). (A DE3 profág hordozza a lac-promóter szabályozása alatt a T7 RNS-polimeráz génjét.)

12.2.2.4. Koexpresszió

A koexpresszió azt jelenti, hogy egyszerre egy sejten belül több polipeptidláncot fejeztetünk ki. Szükségünk lehet erre, ha például egy heterodimer fehérjét kell előállítanunk rekombináns formában. További előny lehet, hogy már a sejten belül létrejön a két polipeptidlánc (vagy fehérje) közötti kölcsönhatás, ami segíthet a láncok feltekeredésében, vagy ha a bennünket érdeklő fehérjével együtt egy módosító enzimet expresszálunk, a posztranszlációsan módosított rekombináns fehérjét izolálhatjuk a gazdasejtből. Jó példa erre, ha egy fehérjét aktív formában szeretnénk előállítani (pl. egyes MAPK enzimeket), de az aktiváló foszforiláció nélkül ez nem sikerülhet. Megoldást jelenthet, ha a MAPK fehérjét az aktiváló protein-kinázzal (MAPKK) együtt fejeztetjük ki. Így megkapjuk a MAPK fehérjét aktív, foszforilált formában. Koexpresszióra prokariótákban többféle lehetőségünk van:

  • Egy promóter, több RBS és inszert cDNS, azaz egy policisztronos mRNS-t kapunk, amelyről több fehérje expresszálódik (mint a bakteriális operonoknál). Ilyenkor a mRNS-hez több riboszóma is kötődik az RBS-eknek megfelelően, és egyszerre kezdi a fehérjék szintézisét. Megjegyzendő, hogy a promóterhez közelebb elhelyezkedő ORF-ről több polipeptidlánc fog szintetizálódni.

  • Több azonos promóter egy plazmidon, amelyről így többféle mRNS íródik át. A módszert például heterodimer fehérje előállítására használhatjuk.

  • Több plazmid, amely különböző inszertet hordoz. De ennek feltétele, hogy más legyen a plazmidok replikonja, azaz különböző kompatibilitási csoportba tartozzanak és különböző antibiotikum rezisztencia gént hordozzanak (ld. 7.2.1. fejezet).

  • Egy promóterhez fúziós fehérjeként kapcsoljuk a két különböző fehérjeláncot. Azaz nem használunk STOP kodont az első fehérjét kódoló szekvencia után, hanem rögtön következik a másik polipeptidet kódoló szekvencia.

12.2.3. Fúziós rekombináns konstrukciók

Sokszor az is megoldás lehet a sikertelen expresszióra, ha a kívánt fehérjénket fúziós fehérjeként fejeztetjük ki. Ekkor a fehérjénk vagy N-, vagy C-terminális részére, vagy mindkettőre tervezhetünk címkét (tag-et). Ezek a címkék segíthetik a

  • fehérjénk oldhatóságát, expresszióját,

  • olyan szignál szekvenciákat tartalmazhatnak, amelyek megfelelő kompartmentekbe irányítják a fehérjét,

  • segítik a fehérje tisztítását affinitás kromatográfiával

  • lehetővé teszik a fehérje nyomonkövetését is, pl. enzimaktivitásuk révén vagy antigénként szolgálhatnak Western-blot esetén

A 12.1. videon egy fúziós rekombináns fehérje tisztítása mutatjuk be affinitás kromatográfiával, FPLC készülék segítségével

12.1. video: Fúziós rekombináns fehérje tisztítása affinitás kromatográfiával (FPLC)

12.2.3.1. GST-címke

A GST, azaz a glutation-S-transzferáz olyan enzim, amely glutation felhasználásával a sejtben lévő kis toxikus molekulákat lebontja. A GST kompakt, globuláris, nagyon stabil fehérje, 25 kDa molekulatömeggel. Nagyon jól kifejeződik és oldatban marad prokarióta sejtekben, ráadásul segíti a hozzá kovalensen kapcsolt fúziós partner kifejeződését is, ha a kifejezendő fehérje N-terminálisára tesszük. Továbbá a GST-címkén keresztül a fehérje nagyon jól tisztítható affinitás kromatográfiával. Az előre gyártott glutation-agaróz gyantához (számos cég árulja) ugyanis a GST nagyon nagy affinitással kötődik (szubmikromólos a KD). A gyantához nagy affinitással kötődő fehérjéket szabad glutationt tartalmazó oldattal (10-20 mM) eluálhatjuk. Így elég tiszta fehérje preparátumot kapunk. A GST-gyanta nagy kapacitácú; 1 ml tiszta gyanta kb. 6-8 mg fehérjét tud megkötni, és használat után regenerálható. GST-címkével expresszálhatjuk a fehérjénket, ha pl. pGEX expressziós vektorok valamelyikével dolgozunk. Részletesebben itt olvashatnak róla.

12.2.3.2. MBP-címke

Az MBP (maltose-binding protein), vagyis a maltóz-kötő fehérje az E. coli malE génjének 42 kDa tömegű terméke. A fehérje a baktérium maltóz transzportjában játszik nagy szerepet, emiatt erős affinitással kötődik a maltózhoz (a KD kisebb, mint 1 µM). Ez a tulajdonsága lehetővé teszi, hogy az agaróz gyöngyhöz immobilizált maltóz a sejtlizátumból megkösse az MBP-fúziós fehérjénket, amelyről szabad maltózzal eluálható a fehérje. Az elúciós oldatunk kb. 10-30 mM maltózt kell tartalmazzon. Mivel a fehérje a baktérium saját fehérjéje, ezért az N-terminálisan hozzákapcsolt fehérje expressziós tulajdonságait (pl. oldhatóság) is jelentősen javíthatja. MBP-fúziós fehérjét a pMal sorozat (New England Biolabs) vektoraival lehet előállítani.

12.2.3.3. Polihisztidin-címke

Talán a leggyakrabban használt fúziós rendszer. 6-10, de leggyakrabban 6 hisztidin aminosavból  álló címke, amit tervezhetünk a fehérje N-, vagy C-terminális végére is. Kisméretű címke, ezért feltehetően a legkevésbé zavarja a fehérje működését. Nagy affinitással kötődik a Ni-gyantához (Ni2+-ionokat kötnek koordinációs kötéssel a gyanta speciális csoportjaihoz). A kötődés azon alapul, hogy a Ni2+-ion koordinációs szférájának a felét foglalják csak el a gyanta funkciós csoportjai, így a hisztidin imidazol gyűrűjének nitrogénatomja koordinációs kötést hoz létre a fémionnal is. Ez a kötés elég erős, de fémkelátorokra (EDTA, EGTA) nagyon érzékeny. Ezért az affinitás kromatográfiai lépések során ezeket a komponenseket kerülni kell, mert „leszedik” a fémiont a gyantáról. Szintén kerülni kell a Ni-ionnal csapadékot képező vegyületeket, ilyenek a biokémiai redukálószerek, a DTT, vagy a béta-merkaptoetanol, mivel ezek tönkreteszik a gyantát, illetve az oldat pH-ja sem lehet túl lúgos, vagy savas. Viszont ezt az affinitás kromatográfiás lépést lehet erős detergens jelenlétében, vagy denaturáló körülmények között is használni (pl. preparálás inklúziós testből). Nemcsak Ni2+-ion, hanem Co2+-ion is lehet az agaróz gyantához koordinálva, ezért ezt a tisztítási módszert fém-affinitás kromatográfiának (metal-affinity chromatography) hívjuk.

Az elúció itt is kompetíción alapul, imidazol oldattal (50-500 mM) szorítjuk le a gyantáról a fehérjénket. Ez a legelterjedtebb módszer, de az elúció megoldható a pH csökkentésével is. Ilyenkor lassan csökkentjük a pH-t, először a kevésbé specifikus kötések, majd az erősebb kötések szűnnek meg. Az ok, hogy a pH csökkenésével a hisztidin nem-kötő elektronpárral rendelkező N-atomja protonálódik, és nem tud koordinálódni a Ni2+-hez. Ezáltal fokozatos elúciót érhetünk el, így tisztább lehet a fehérje preparátumunk (a Ni2+-gyanta nemcsak polihisztidin-címkés fehérjéket köt, hanem más fehérjéket is, ahol térközelben vannak hisztidin aminosavak, persze azokat kisebb affinitással). A 12.7. ábrán látható egy 85 kDa tömegű fehérje Ni2+-affinitás kromatográfiával történő tisztítása.

A tisztítás különböző lépéseiben mintát vettünk, és megfuttattuk SDS-poliakrilamid gélen, amit fehérjefestékkel (Coomassie Brilliant Blue) hívtunk elő. Látható, hogy a 100 mM imidazollal történő elúció nem elég ahhoz, hogy leszorítsa a gyantáról a fehérjénket, míg 400 mM imidazollal nagy mennyiségű, viszonylag tiszta preparátumot kapunk.

A His-taget gyakran kombinálják más címkékkel is, pl. N-terminális GST-, vagy MBP-fúzióval. A tisztításnál először Ni2+-affinitás kromatográfiával izoláljuk a sejtlizátumból a fehérjét, majd a másik címke felhasználásával a másik kromatográfiás tisztítást is elvégezzük. Ezáltal jelentősen megnövekszik a fehérje tisztasága és ha a két címke a fehérje két oldalán található, ez lehetőséget teremt arra is, hogy csak a teljes hosszúságú fehérje maradjon a preparátumban.

Ni2+-affinitás tisztítás gélelektoforetikus képe

12.7. ábra: Ni2+-affinitás tisztítás gélelektoforetikus képe. 1. sáv: fehérje marker; 2. sáv: a sejt nem oldható frakciója (centrifugálás utáni csapadék); 3. sáv: a sejt oldható frakciója (felülúszó); 4. sáv: elúció 100 mM imidazollal; 5. sáv: elúció 400 mM imidazollal

12.2.3.4. Egyéb címkék

Nagyon sok expressziós vektor kínálja fel a lehetőséget, hogy N-, vagy C-terminális címkével fejeztessük ki a fehérjénket (ld. 12.2. táblázat).

12.2. táblázat: Fúziós címkék és alkalmazásaik

A kérdés csak az, mi a célunk. Növelni akarjuk a fehérje oldhatóságát, expresszióját vagy nagyobb mértékű tisztítást szeretnénk elérni? Nyomon szeretnénk követni a fehérjénk kifejeződését, lokalizációját pl. eukarióta sejtekben? Általában elmondhatjuk, hogy egy címkének több funkciója is van, és csoportosításuk egyik alapja éppen a felhasználás lehet. Ez alapján beszélhetünk affinitás, szolubilizációs, epitóp, vagy akár fluoreszcens címkéről is. Egy-egy címke több csoportba is besorolható, pl. a GST-címke növeli a fehérje oldhatóságát, lehet affinitás-alapú tisztításra használni, és még ellenanyag is készült rá, amivel nyomon lehet követni. Az alkalmazott címkék ellen általában létezik ellenanyag, így Western-blottal vagy eukarióta sejtek esetén immunfestéssel láthatóvá tehetők. Léteznek olyan eukarióta vektorok is, amelyek fluoreszcens fehérjéket, vagy enzimaktivitással rendelkező fehérjéket kínálnak fúziós címkének. Ilyen címke a GFP (green fluorescent protein) és változatai, vagy az enzimaktivitással rendelkező β-galaktozidáz, illetve luciferáz. Ezeket azonban felhasználásuk miatt az eukarióta expressziós rendszernél tárgyaljuk.

Az expressziós címkék használatáról itt találnak további hasznos információkat.

12.2.3.5. A fúziós címkék eltávolítása

A nagyobb méretű címke jelenléte befolyásolhatja a fehérje biológiai funkcióját pl. aktivitását, kötődését más fehérjéhez, vagy a harmadlagos, negyedleges szerkezetének kialakulását. Például a GST dimerizációra hajlamos, így már eleve rákényszerítheti a fúziós partnerét is, hogy dimerizáljon. Ezen okok miatt érdemes tisztítás után a fehérjéről valamilyen proteázzal levágni a fúziós címkét. Számos vektorban már eleve betervezték a proteáz hasító/felismerőhelyét. Természetesen olyan enzimeket kell használni, amelyeknek nagyon speciális hasítóhelye van, és ritkán fordul elő a fehérjékben, így nem hasítja más helyeken is a rekombináns fehérjénket. Néhány esetben a kémiai hasítás is szóba jöhet; pl. a bróm-cián AspPro aminosavak között hasít. A 12.3. táblázat foglalja össze a leggyakrabban használt proteolitikus enzimeket hasítóhelyeikkel együtt.

A proteázzal való hasítás történhet az elúció után, oldat fázisban. Ilyenkor a fúziós címkétől, a nem hasított fúziós fehérjétől és a proteáztól is meg kell tisztítanunk a fehérjénket valamilyen kromatográfiával. Kisméretű (peptid) címkéket el lehet távolítani dialízissel, vagy gélszűréssel. Másik lehetőség, hogy a gyantára felkötött és mosással tisztított fehérjéről az oszlopon hasítjuk le a fúziós címkét. Ilyenkor a címke az affinitás oszlopon marad, míg a fehérjénk „lecsöpög” az oszlopról. Ekkor csak a proteáztól kell megszabadulnunk. Vigyáznunk kell, hogy a proteáznak és a fehérjénknek is megfelelő puffert alkalmazzunk a hasítás során.

12.3. táblázat: Fúziós címke lehasítására alkalmas proteolitikus enzimek és jellemzőik

12.2.4. Rekombináns fehérjék termelése és izolálása

Ha optimalizáltuk fehérjénk expresszióját, és tudjuk azt is, hogy a sejt mely részéből kell tovább tisztítanunk, akkor elkezdhetjük a nagyobb mennyiségű fehérje termelését célzó, nagy léptékű expresszió végrehajtását, amely a következő alfejezetekben ismertetett lépésekből áll.

12.2.4.1. Indító (starter) kultúra elkészítése

Az elkészült rekombináns DNS konstrukciót transzformáljuk a megfelelő expressziós törzsbe (pl. BL21(DE3)). A transzformátumot megfelelő antibiotikumot tartalmazó szilárd táptalajra szélesztjük és 37ºC-on inkubáljuk. Másnap egy jól körülhatárolt telepet antibiotikumot tartalmazó 50 ml LB-tápba oltunk . Ez lesz a starter kultúra, amit 37ºC-on rázatás mellett növesztünk. 12-16 óra múlva, a starter kultúra megfelelően felszaporodik.10-20 ml-ét 1l megfelelő antibiotikumot tartalmazó folyékony táptalajba oltjuk, amivel elindítjuk az expressziós kultúránk növesztését. A megfelelő expressziós klón folyadékkultúrában felnövesztett szuszpenziója 10% glicerinnel (amely ez esetben a fagyálló szerepét ötli be) elkeverve lefagyasztható és -80°C-on hosszú ideig tárolható. Ilyen glicerines expressziós klóntár létrehozásával kiválthatjuk a gyakran használt klónok expressziós sejtbe való transzformálását, elég a fagyasztott kultúra töredék részét szilárd táptalajra inokulálni.

12.2.4.2. Az expressziós kultúra növesztése és indukciója

A megfelelően inokulált (ld. 12.2.4.1. ) baktérium tenyészetet 37°C-on, folyamatos rázatás (140-200 rpm) mellett inkubáljuk. Egy rázóinkubátort a 12.8. ábrán, míg az expressziós kultúrához szükséges eszközök csíramentesítését és a sejtkultúra növesztését a 12.2. videon mutatjuk be. Inkubáció közben nyomon követjük az osztódó baktériumtenyészet sűrűségét. A tenyészet sűrűsége jelzi az osztódások előrehaladását, a baktériumpopuláció szaporodását és egyszerűen, az optikai denzitás 600 nm-en való mérésével, spektrofotométeren mérhető. OD600 nm = 0,8 körüli értéknél a baktériumkultúra készen áll az indukcióra. Ha szükséges, hűtsük le az indukció hőmérsékletére és vegyünk belőle mintát a későbbi SDS-gélfuttatáshoz. Ez lesz az indukció előtti minta. Ha a termosztátunk hőmérséklete elérte az indukcióhoz szükséges értéket tegyük bele a megfelelő mennyiségű induktort, ami a leggyakrabban IPTG. Inkubáljuk és rázassuk a megfelelő ideig, majd vegyünk belőle mintát. Ez lesz az indukció utáni minta. Az expressziós kultúrából a következő lépesek során tisztítjuk a termelt rekombináns fehérjét.

12.8. ábra: Rázató inkubátor prokarióta és eukarióta szuszpenziós kultúrához

12.2. video: Expressziós kultúrához szükséges eszközök csíramentesítése és a sejtkultúra növesztése

12.2.4.3. A sejtek összegyűjtése (harvesting)

Ahhoz, hogy a sejtekből a fehérjét a megfelelő tisztítási lépésekkel izoláljuk, először össze kell gyűjtenünk a sejteket a táptalajból. Ez a lépés centrifugálással történik (5000 g x 10 min, 4°C-on). A tisztítás során mindig jégben, vagy 4°C-on dolgozunk, hogy ne degradálódjon a fehérje. A sejteket meg kell tisztítanunk a táptalajtól, amit legtöbbször egy pufferrel (pl. PBS) való mosással végzünk. A sejteket ezután újra centrifugálással gyűjtjük össze.

12.2.4.4. A sejtek feltárása

Az összegyűjtött sejteket lizálva a sejtben levő fehérje kinyerhető. A lízist a sejtek lízis pufferben való inkubálásával végezzük. 1g baktérium sejtre általában 3-4 ml lízis puffert számolunk.

A lízis puffer összetétele:

  • Megfelelő pH-t biztosító puffer (általában 7-9 pH-tartományban): pl. 20 mM TRIS, foszfát puffer.

  • Só, ami ionerősséget biztosít, általában NaCl, 0,15-0,5 M.

  • Detergens, ami segíti a sejtek feltárását, illetve a fehérjék oldatban tartását és csökkenti az aspecifikus kölcsönhatásokat, pl. 0,1-0,2% Tween20, CHAPs, TritonX 100.

  • Glicerin 5-10%-ban, ami stabilizálja a fehérjéket.

  • Redukálószer, a nem megfelelő diszulfidhidak redukálásához: 2-10 mM béta-merkaptoetanol (a DTT-re és DTE-re vigyázni kell fém-affinitás kromatográfia esetén).

  • Proteáz gátlók, a sejtek degradálódásának kivédésére: pl. 1 mM PMSF, 1-5 mM benzamidin.

A lízist segíti, ha többszörös fagyasztást-felolvasztást alkalmazunk, és/vagy ha a felszuszpendált sejtkultúrához lizozimot adunk. A lizozim képes a baktériumok sejtfalát bontani és ezért alkalmas a lízisre. Nagyon hatásos a Gram-pozitív baktériumoknál, de a Gram-negatív baktériumoknál is hasznos, ha detergenssel, vagy ozmotikus sokkal együtt alkalmazzuk. Szonikálással (a sejtek ultrahang segítségével történő feltárásával) is segíthetjük a sejtek lízisét, és a benne lévő DNS darabolását. Vigyázzunk azonban, mert szonikálás hatására melegszik az oldat, ami a preparátumban lévő proteázok aktivitásának növekedését, így a fehérjénk degradálódását okozhatja, és emellett a fehérjénk denaturációjához vezethet. Ezért ezt a folyamatot jégben és szünetekkel végezzük (1 perc szonikálás meghatározott frekvenciával, majd egy perc szünet). Ezt a lépést ismételjük 3-4-szer, míg a preparátum hígan folyóssá nem válik. Ezután DN-áz I enzimmel kezeljük, ami a DNS-t kisebb darabokra vágja. A sejtek feltárását végezhetjük erős detergenssel (TritonX 100 1-2%), deoxikólsavval vagy az ún. French-Press készülékkel is (ez utóbbiban a nagy nyomás tárja fel a sejteket). A feltárás után centrifugálással elválasztjuk az oldható és az oldhatatlan frakciót. A felülúszó a lízispufferben oldódó fehérjéket, komponenseket, míg az oldhatatlan frakció (csapadék) a sejttörmeléket és az inklúziós testet tartalmazza. A további lépések attól függenek, hogy hol található a fehérjénk; a felülúszóban oldható formában, inklúziós testben oldhatatlan formában, vagy a periplazmás térben.

12.2.4.5. Izolálás oldható frakcióból

Ha a fehérjénk az oldható frakcióban van jelen, feltehetően natív formában, akkor ezt a protokollt kell követnünk. A baktérium lizátumban számos fehérje van, köztük proteázok is, amelyek emészthetik a rekombináns fehérjénket. A tisztítás során ezeket el kell választanunk. A sejtek összegyűjtése után a felülúszót visszük tovább, és a címkének megfelelő affinitás kromatográfiás tisztítási lépés következik. Amennyiben a fehérjénk tartalmaz polihisztidin címkét, ezt a legcélszerűbb alkalmazni, mert nagy affinitású és denaturáló körülmények között is működik.

12.2.4.6. Preparálás zárványtestből (inclusion body)

Ha a fehérjénk nem az oldható fázisban, hanem a csapadékban van jelen, akkor fel kell oldanunk, amire számos lehetőség kínálkozik: 5-8 M guanidin-HCl, 6-8 M urea, SDS-oldat, lúgos pH. A csapadékot először mossuk 1-2% Triton X 100 oldattal, majd centrifugáljuk. A mosott csapadékot szolubilizáló oldatban (5-8 M guanidin-HCl vagy 6-8 M urea) vesszük fel. A csapadékot fel-le pipettázással oldjuk, és 4ºC-on több órán át állni hagyjuk. Inkubálás után tisztítás céljából ismét lecentrifugáljuk az oldatot, de most már a felülúszó tartalmazza a feloldott fehérjénket, igaz a denaturálószerben. Választhatunk, hogy elvégezzük denaturáló körülmények között a fém-affinitás kromatográfiát, vagy megpróbáljuk renaturálni a fehérjét, és utána alkalmazzuk a tisztítási lépést. Legcélravezetőbb az először alkalmazott fém-affinitás kromatográfia, hisz ez, mint már említettük, denaturáló körülmények között is jól működik, feltétele viszont, hogy a fehérjénk tartalmazzon His-címkét. A gyantára felkötött és mosott fehérjét vagy olyan elúciós pufferrel eluáljuk, ami még tartalmazza a denaturálószert, vagy lecseréljük a mosó-eluáló puffert denaturálószer nélküli pufferre.

Amennyiben az elúciós puffer is tartalmaz denaturálószert, akkor meg kell szabadulni tőle, hogy a fehérjénk renaturálódni tudjon. Erre legjobb módszer a dialízis. Ez történhet lépésenként, azaz fokozatosan csökkentjük a dializáló pufferben a denaturálószer koncentrációját, és közben emeljük a NaCl mennyiségét, hogy ne aggregálódjon a fehérje. A dialízis során a fehérje visszanyeri a szerkezetét, és remélhetőleg a biológiai aktivitását is. Ezt persze függ a fehérjétől, minél több doménből áll egy fehérje, annál reménytelenebb a renaturáció. Szintén reménytelen a renaturáció, ha a fehérjénk feltekeredéséhez az eredeti sejtkörnyezetben dajkafehérjékre van szükség. A dialízis során a ciszteint tartalmazó fehérjéknél mindenképpen alkalmazzunk redukálószert: DTE, DTT, béta-merkaptoetanol, TCEP (Trisz-karboximetil-foszfin). Ennél a módszernél nagyon fontos, hogy a fehérje elég jól renaturálódjon, és visszanyerje biológiai aktivitását. Előnye viszont, hogy nagy tisztaságú és általában nagy mennyiségű fehérjét lehet előállítani. Az inklúziós test nagyon kevés egyéb fehérjét (és így proteázt) tartalmaz, a rekombináns fehérjénk akár az összefehérje 90%-a is lehet.

12.2.4.7. Izolálás periplazmából

A periplazmás tér a Gram-negatív baktériumok külső és belső membránja közötti tér. Itt jobb lehetőségek kínálkoznak a megfelelő foldingra és a diszulfidhíd képződésre. Ide megfelelő N-terminális szignál szekvenciát tartalmazó fehérjék jutnak el. Ilyen szekvencia az ompA, pelB, vagy a phoa-fúziós fehérjék. Ilyenkor a tisztításhoz használt címkét a C-terminálisra kell tenni.

A sejt feltárása enyhébb körülmények között, nem szonikálással, hanem ozmotikus sokkal történik. A sejteket 80 ml puffer/1 g sejtcsapadék mennyiségű lízis pufferben kell felvenni, amely tartalmaz 20% szacharózt is. Az izoozmotikus oldatban lévő sejteket centrifugáljuk (8000 g x 20 min, 4ºC), majd szuszpendáljuk őket nagy mennyiségű 5 mM MgCl2 oldatban, végül újabb centrifugálás következik. Az így biztosított hipoozmotikus körülmények között a periplazmás fehérjék már a felülúszóba kerülnek.

Másik bevált módszer, hogy az összegyűjtött sejteket rögtön a MgCl2 oldatban vesszük fel, ami hipoozmotikus sokk a sejtnek, és óvatosan lefagyasztjuk -20ºC-on, majd óvatosan felengedjük. Ilyenkor a sejt külső membránja megsérül, de a belső épen marad. Így centrifugálással elválaszthatjuk a sejteket, míg a felülúszóban marad a periplazmatikus tér tartalma.

12.2.5. A prokarióta expresszió előnyei, hátrányai

Egyik legfontosabb előnye, hogy viszonylag gyors (ha kész a konstrukció, 3-4 nap alatt termelhető a fehérje), olcsó, és nagy mennyiségű fehérje állítható el vele. Hátránya, hogy a fehérjéről hiányzik az esetleges poszttranszlációs módosítás (foszforiláció, glikoziláció, acetilálás), problémás lehet az S-S hidak képződése, illetve a fehérje feltekeredése. Sokszor a nagyobb, több doménből álló fehérjéket is rosszul lehet kifejeztetni ebben a rendszerben. Végül emlékeztetünk a kodon preferenciára, ami ha nem megfelelő, korai termináció jöhet létre (bár ez a veszély megfelelő törzzsel csökkenthető (ld. 12.2.2. fejezet).