13. fejezet - Eukarióta expressziós rendszerek

Tartalom

13.1. Élesztő expressziós rendszer
13.1.1. Az expressziós kazetta
13.1.2. Szelekciós markerek
13.1.3. Szekréció
13.1.4. Poszttranszlációs módosítások
13.1.5. Az expresszió lépései
13.1.6. Élesztő expressziós vektorok és rendszerek
13.1.7. Az élesztő expressziós rendszer előnyei és hátrányai
13.2. Bakulovírus expressziós rendszer
13.2.1. „Bac-to-Bac” rendszer
13.2.2. Közvetlen bakulovírus (Direkt Bac) rendszer
13.2.3. A bakulovírus rendszer előnyei és hátrányai
13.3. Emlős expressziós rendszer
13.3.1. Emlős expressziós vektorok
13.3.2. Sejtvonalak
13.3.3. Génbevitel emlős sejtbe
13.3.4. Indukálható emlős expressziós rendszerek
13.4. Egyéb eukarióta expressziós rendszer
13.4.1. Dictyostelium discoideum expressziós rendszer
13.4.2. Drosophila melanogaster expressziós rendszer
13.5. Eukarióta sejttenyésztés
13.6. További olvasnivaló a fejezethez

Napjainkban a fehérjemérnökségnek egyre nagyobb jelentősége van nemcsak a kutatásban, hanem a gyógyászatban is. Biotechnológiai cégek alakulnak, hogy ellenanyagokat, hormonokat, növekedési faktorokat és egyéb polipeptid típusú molekulákat állítsanak elő (sokszor közvetlenül gyógyászati célból; ld. pl. 15.1.3. fejezet). A bakteriális expresszió általában ellát bennünket nagy mennyiségű rekombináns fehérjével, de a fehérjénk nem biztos, hogy fel tudja venni a biológiailag aktív formáját. Ennek oka lehet egyrészt, hogy a baktériumban kevés és más dajkafehérjék (chaperonok) működnek, így nem lesz megfelelő a fehérjelánc feltekeredése (foldingja) és a szerkezete. Másrészt a poszttranszlációs módosítások sem érvényesülnek, pl. foszforiláció, glikoziláció, stb. Harmadrészt, a citoplazma reduktív környezete miatt a megfelelő diszulfid-hidak sem tudnak kialakulni. Nagyméretű, több doménből álló fehérjék előállítása is problémás lehet prokarióta rendszerben. Erre az in vitro rendszer részben megoldást jelenthet, hisz elérhető emlős, vagy akár humán sejtmentes kivonat is. Ezek hátránya azonban, hogy kevés fehérje állítható elő velük. Ha ilyen problémával találkoznunk, meg kell keresni a megfelelő eukarióta expressziós rendszert. Milyen feltételei vannak egy jó expressziós rendszernek?

13.1. Élesztő expressziós rendszer

A fejezet bevezetőjében említett céloknak majdnem teljesen megfelel az élesztő, a legegyszerűbb eukarióta gazdasejt. Genetikája, biokémiája nagyon jól ismert, már több mint 30 éve használják rekombináns fehérje termelésre. Nagyon sok élesztő faj ismert (kb. 800), ebből sok alkalmas fehérjetermelésre. A két leggyakrabban használt élesztő a Pichia pastoris, illetve a közönséges sörélesztő, a Saccharomyces cerevesiae. Ezen a két rendszeren keresztül mutatjuk be az élesztő expressziós rendszerek jellemző tulajdonságait. Az élesztőben használható vektor típusokat már röviden áttekintettük a 7.6. fejezetben.

Minden expressziós rendszer két alapvető egységből áll: a megfelelő gazdasejtből és az expressziós vektorból. Az expressziós vektornak hordoznia kell azokat a szekvenciákat, amely biztosítja a gazdasejtben a replikációt, és a kívánt fehérje kifejeződését. Az élesztő vektorok shuttle („ingázó”) vektorok, mivel a baktériumsejtek és az expressziós sejtjeink (élesztő, rovarsejt, emlőssejt) is replikálni tudják. Ez úgy érhető el, hogy mindkét gazdasejt típusra specifikus replikonnal rendelkeznek. Mivel minden fehérjetermelés első lépése az expressziós konstrukció létrehozása és a molekuláris klónozás, a rekombináns DNS konstrukció felszaporítása E. coli gazdában a legegyszerűbb, leggyorsabb és legolcsóbb. Ezt a műveletet bármilyen expressziós gazdasejtet is használunk, a bakteriális rendszerben végezzük el.

Alapvetően kétféle típusú élesztő vektor létezik: replikálódó és integrálódó. A replikálódó (episzomális) vektor extrakromoszomális formában szaporodik a gazdasejtben. Ilyen vektor használatakor általában csak átmeneti (tranziens) expresszióról beszélünk és a vektornak tartalmaznia kell egy élesztőben működő replikációs start szignált is. A másik esetben a kifejezendő fehérje cDNS-e homológ rekombinációval az élesztő genomjába integrálódik. Ekkor stabil expresszióról beszélünk, azaz a rekombináns transzformált törzs megőrzi a transzgént, a törzs fenntartható akár hosszú távon is. A homológ rekombinációt integrálódó vektorokkal érjük el, amelyek tartalmaznak a genomi DNS szekvenciával homológ szekvenciákat. A homológ rekombináció hatásfoka elég kicsi, ezért mindenképpen ki kell válogatni a transzformálódott sejteket. Erre a célra szelekciós markereket használunk, amit a vektorunk kódol. Az expressziós kazetta hordozza a kívánt fehérjét kódoló szekvenciát és annak kifejeződéséhez szükséges elemeket; promóter, transzkripciós terminációs szekvencia, riboszóma kötőhely (Kozak szekvencia). Itt található a multiklónozó hely (MCS), ahová a klónozás során bevisszük a fehérjét kódoló szekvenciát.

Összefoglalva, az élesztő expressziós vektorok fő elemei:

  1. bakteriális elemek: bakteriális replikációs origó, bakteriális antibiotikum rezisztencia gén

  2. élesztő genetikai elemek, amelyek a homológ rekombinációért vagy a vektor replikációjáért felelősek (ARS: autonomous replication sequences)

  3. szelekciós markerek

  4. expressziós kazetta

13.1.1. Az expressziós kazetta

A fehérje expresszió legmeghatározóbb eleme a promóter. Milyen legyen egy jó promóter? Nagymértékű és speciális expressziót biztosítson, amit lehet szabályozni, indukálni. Erre legalkalmasabbak a glikolitikus, vagy más metabolikus utak enzimeit kódoló gének promóterei. A következőkben a leggyakrabban használt promótereket foglaljuk össze:

S. cerevisiae promóterek:

  • Nagyon erős, de csak gyengén indukálható promóterek: PGK (foszfoglicerát-kináz), GAPD (glicerin aldehid-3-foszfát-dehidrogenáz); induktoruk a glükóz

  • Erős promóter: GAL1 (galaktokináz), galaktózzal indukálható.

  • Közepesen erős promóter: ADH2 (alkohol dehidrogenáz), a glükóz represszálja.

  • Közepesen erős promóter: PHO5 (foszfatáz), a foszfát represszálja.

Pichia pastoris promóterek:

  • AOX1 promóter: a Pichia pastoris alkohol-oxidáz génjének promótere.

Az alkohol-oxidáz enzim a levegő oxigénjének felhasználásával a metilalkoholt formaldehiddé oxidálja, miközben hidrogén-peroxid keletkezik. (A folyamat a peroxiszómában játszódik le, így nem káros a sejtnek.) Ez a promóter nagyfokú expressziót biztosít, metilalkohol hatására akár 5% lehet az enzim mRNS-ének a mennyisége a teljes mRNS mennyiségre vonatkoztatva, a fehérjeszint pedig az összes fehérje 30%-át is elérheti. Tudnunk kell, hogy a Pichia metilotróp élesztő, azaz metanolt tud használni egyedüli szén-és energiaforrásként, ha nincs a médiumban glükóz és glicerin. Tehát a glükóz és a glicerin represszálja, a metilalkohol pedig indukálja a promóter után lévő szekvencia átírását. Ez egy ideális promóter, hiszen indukálható módon nagymértékű expressziót biztosít.

  • AOX2: a másik alkohol-oxidáz enzim génjének promótere. Szintén indukálható metilalkohollal, de 10-szer kisebb expressziót biztosít.

  • DHAS: a dihidroxi-aceton-szintetáz gén promótere. Ez a promóter is a metanol metabolizmusban játszik szerepet, azaz metanollal indukálható, de nincs olyan erős, mint az AOX1.

  • FLD1: a formaldehid dehidrogenáz gén promótere szintén a metanol hasznosításban játszik szerepet. De metanol mellett metilaminnal is indukálható, így a metilamin indukció esetén glükóz és glicerin is használható szénforrásként.

  • GAP1: a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz promótere állandó expressziót eredményez, azaz konstitutív promóter. Akkor használható, ha a termelt fehérje nem toxikus a sejtre, illetve nem gátolja a sejt osztódását.

  • AOX1-GAP1: tandem promóter, amellyel még nagyobb expresszió érhető el.

További szabályozó elemek:

A promóter mellett ezeknél a vektoroknál is fontos, hogy az expressziós kazetta tartalmazzon transzkripciós terminációs szekvenciát, valamint a mRNS processzálásához és a poliadenilációhoz szükséges elemeket. Legtöbbször a PGK, GAPD és CYC1 gének transzkripciós terminációs szekvenciáját használják. Fontos még a transzláció iniciációjához szükséges szekvenciák jelenléte is. Ezt a szekvenciát eukariótákban Kozak szekvenciának nevezzük, ami nélkül nem, vagy nagyon gyengén megy az expresszió. Egyes vektorokban (különösen N-terminál fúziós konstrukciókban) ez már adott, különben nekünk kell beépítenünk.

13.1.2. Szelekciós markerek

Szelekciót két különböző elv alapján végezhetünk. Az egyik esetben az expressziós vektor bioszintetikus utak enzimeit kódolja, pl. HIS3, HIS4, ADE1, URA3, LEU2, TRP1. Ebben az esetben olyan törzset kell használunk, amelyben az adott enzim defektes (mutáns) és ezért nem tud szaporodni olyan tápoldatban, ami nem tartalmazza a szintézisében gátolt anyagot, pl. hisztidint, leucint, triptofánt vagy az uracilt (ezeket a törzseket auxotrófnak hívjuk). Például HIS3 szelekciós marker gén használata esetén a hisztidin bioszintézisében gátolt törzset hisztidint tartalmazó tápoldatban tartjuk fenn. Transzformáció után azonban hisztidin-mentes tápfolyadékban növesztjük.. Ekkor csak azok a sejtek maradnak fenn (szaporodnak), amelyek felvették a vektort, és elő tudják állítani a hisztidin bioszintéziséhez szükséges enzimet.

A másik lehetőség, ha a vektor antibiotikum rezisztencia gént kódol. Azaz a baktérium törzsekhez hasonlóan a rezisztenciagén terméke hatástalanítja a médiumban lévő antibiotikumot (pl. G418, amely egy aminoglikozid antibiotikum, s a neomicin-rezisztencia génnel lehet inaktiválni, vagy zeocin, amely egy glikopeptid és Zeocin rezisztencia géntermék inaktiválja). Ezek a szelekciós ágensek minden eukarióta sejtben működnek, és a rezisztencia dózisfüggő. Így az expressziós vektorból több kópiát tartalmazó törzsek is szelektálhatóak növelve a médium antibiotikum tartalmát.

13.1.3. Szekréció

Az élesztő rendszer egyik legnagyobb előnye, hogy a fehérjék szekrécióját könnyű megoldani. Mivel az élesztő nem nagyon szekretál fehérjét, ezért a rekombináns fehérje szinte az egyedüli, ami megjelenik a táptalajban. A szekréciós szignált ráadásul le is hasítja (szignál-peptidáz), így azt sem kell eltávolítanunk. Ilyen szignál-szekvencia lehet a Saccharomyces cerevisiae α-mating faktorának prepro-szignálja, vagy a Pichia pastoris PHO1 szignálja. Számos esetben a heterológ fehérje saját szignál szekvenciája a legjobb megoldás.

A szekréció nemcsak a tisztítás szempontjából kedvező, hanem a sejt intracelluláris proteázaitól is védelmet jelent. Intracelluláris expresszió esetén proteáz-deficiens törzsek használata jelenthet megoldást. (A két legfontosabb proteáz ebből a szempontból a proteináz-A és -B enzimek). A tápfolyadékban megjelenő proteázok hatását pH optimalizálásával (minden enzim működésének van pH-függése), vagy a fermentációs hőmérséklet csökkentésével lehet minimalizálni (alacsonyabb hőmérsékleten kevésbé működnek az enzimek, illetve kevesebb proteázt szekretálnak.)

13.1.4. Poszttranszlációs módosítások

Az eukarióta élesztő poszttranszlációs módosításai közelebb állnak az emlősökéhez. A termelt fehérjék foldingja megfelelő, a diszulfid-hidak képzése is megtörténik a megfelelő helyen. A legnagyobb bajt a glikoziláció jelenti. Emlősökben O-glikoziláció történik, azaz Ser és Thr aminosavak hidroxil-csoportján keresztül, míg élesztőben N-glikoziláció aszparagin oldalláncon keresztül. Ráadásul a cukor egységek mennyisége és fajtája is nagyon különbözik. Emlősökben a cukoregység N-acetil-galaktózamin, galaktóz és sziálsav, míg élesztőben kizárólag mannóz, és az élesztő fehérjék hiperglikoziláltak. Így az élesztőben gyártott fehérjék emlősökben nagyon erős antigén tulajdonsággal rendelkeznek.

13.1.5. Az expresszió lépései

Az eukarióta expresszió lépései alapvetően megegyeznek a prokarióta rendszer megfelelő lépéseivel (ld. 12.2.4. fejezet). Csak a különbségeket emeljük ki.

  1. Az expressziós kazettában a promóter és transzkripció terminációs szekvencia között van az expresszálandó fehérje kódoló régiója. A terminációs szekvencia ebben a rendszerben esszenciális.

  2. Integrálódó vektor esetében a homológ rekombináció hatékonyságának növelésére a vektort linearizáljuk restrikciós hasítással. Fontos, hogy a hasítás a vektor kromoszomális szekvenciájánál legyen, hogy itt történjen meg a homológ rekombináció.

  3. Az expressziós vektor bevitele az élesztősejtekbe. Az élesztő cellulózt tartalmazó sejtfala miatt nehéz a transzformálás, ezért gyakran a szferoplasztot (a sejtfalától megfosztott élesztősejtet) transzformálják. Több transzformációs eljárás is létezik, pl. a lítium-kloridos és polietilén-glikolos transzformálás. A leghatékonyabb génbevitel azonban az elektroporálás. A replikálódó vektoroknál a fehérjénket kódoló szekvencia extrakromoszomális marad, míg integrálódó vektoroknál megtörténik a homológ rekombináció az élesztő genomba.

  4. A transzformált törzsek kiválasztása a szelekciós markerek segítségével, pl. hisztidin-mentes táptalaj.

  5. Ellenőrző PCR annak kimutatására, hogy a genomban van-e a kívánt DNS. Ez a vektorban lévő primer szekvenciák segítségével, vagy egy vektor-specifikus és egy inszert-specifikus primer pár segítségével történik. A keletkezett PCR-termék jelenléte és mérete mondja meg, hogy a megfelelő helyen van-e az inszertünk.

  6. Ha készen van a rekombináns törzsünk, elkezdhetjük a sejtek növesztését. Az élesztő sejteket 28-30ºC-on növesztjük 220-250 rpm-es rázatás mellett. A viszonylag nagy fordulatszámon való rázatás a megfelelő levegőztetés miatt fontos.

  7. Amennyiben a sejtek elérték a megfelelő sejtsűrűséget, indukálhatjuk a tenyészetet. Pl. Pichia sejteknél metanollal, közben állandóan mintákat veszünk (0, 6 12, 24, 36, 48 72, 96 órában), és SDS-gélelektroforézissel nyomon követjük a fehérjénk termelődését.

  8. Ezt követően kell a sejteket feltárnunk és a fehérjét izolálnunk, tisztítanunk. A sejtek feltárása, amennyiben nem szekretált fehérjéről van szó, a sejtfal jelenléte miatt nagyon nehéz. A fel-leolvasztgatás és a savas-üveggyöngyös ismételt vortexelés azonban sokat segíthet. Alternatív megoldásként használhatunk különböző glikoziláz enzimeket is (zimoláz, lizozim stb.). Szekretált fehérjéket a médiumból gyűjtjük össze.

13.1.6. Élesztő expressziós vektorok és rendszerek

Az élesztő sejtekben a baktériumokhoz hasonlóan előfordulnak plazmidok. Legismertebb a sörélesztő (S. cerevisiae) „2-mikron” plazmidja, amelyik egy 2 mm átmérőjű cirkuláris DNS, mely autonóm módon replikálódik. Replikonja az origóból és a REP (represszor) szabályozó génből áll. Amíg a plazmid kópiaszáma magas, a kromoszomális DNS-sel együtt replikálódik. Amikor ez lecsökken, beindul a plazmid független replikációja, míg el nem éri a sejtenkénti 30-50 kópiát. Ezt a plazmidot YEp-nek (yeast episomal plasmid) is nevezik. Ebből származnak a YEp sorozat vektorok, amelyek stabil plazmidok, egyenlő mennyiségben válnak szét (szegregálódnak) a leánysejtek között.

Egy másik lehetőség arra, hogy függetlenül replikálódó élesztő vektort kapjunk, hogy egy cirkuláris DNS tartalmazza azt a kromoszomális szekvenciát, ami a replikációért felelős. Ezt az elemet független replikálódó szekvenciának hívják (ARS: autonomously replicating sequnces). Nagy kópiaszámot eredményez, de gyakran instabil, könnyen elveszthetik a sejtek a rekombináns plazmidot mitóziskor. Az ilyen típusú élesztő vektorokat YRp-nek (yeast replicating plasmid) nevezzük. A YEp és YRp sorozat tagjai a replikálódó plazmid-alapú vektorok, míg a YIp plazmidok (yeast integrating plasmid) a genomba integrálódóak. Ha az ARS-t tartalmazó plazmidba beépítünk a kromoszóma centromerjéből származó CEN szakaszokat, amelyek a kromoszómák mitotikus orsóhoz való kapcsolódásáért felelősek, ekkor stabilizálni tudjuk vele a plazmidot, nem vész el osztódás során. Így kapjuk a YAC vektorokat, amelyek a replikációhoz és az utódsejtbe jutáshoz minden elemet tartalmaznak (ld. 7.5. fejezet).

Az ismertetett négy élesztő vektor típust (integrálódó, replikálódó, episzomális és élesztő mesterséges kromószóma) élesztő expressziós vektorként használhatjuk (ld. 13.1. ábra)

13.1. ábra: Az élesztő vektorok típusai

A sörélesztő gazdasejtben használható expressziós vektorok pl. az Invitrogen cégtől beszerezhető pYES2 vektorok vagy a Novagen cég pYX vektorsorozata (sokszor a név is utal a vektor fajtájára, pl. pYES2 egy replikálódó „yeast episomal” plazmid). A Pichia rendszer plazmidjai általában integrálódó plazmidok, pl. pHIL-D2. Ezen a linken számos élesztőben vagy más gombában használható, különböző elven működő vektorról olvashatnak további részleteket. Expressziós kitek is beszerezhetők, amelyek az élesztő rendszerben használhatók. Ezek különböző expressziós vektorokat, némelyek élesztő törzseket, a szelekcióhoz szükséges anyagokat, szekvenáló primereket és más segédanyagokat tartalmaznak. Ráadásul nagyon pontos leírást adnak arról, hogyan kell lépésről-lépésre végrehajtani a rekombináns fehérjék termeltetését. Részletes ismertetőjük itt található.

13.1.7. Az élesztő expressziós rendszer előnyei és hátrányai

Röviden összefoglalva az élesztő expressziós rendszer előnyei:

  • olcsó, könnyen kezelhető

  • alkalmas fehérje szekrécióra, és a médiumból könnyen kinyerhető a termelt fehérje

  • nagy a kitermelés; egy liter kultúrából 5-10 g fehérje is kinyerhető (a Pichia rendszerrel)

  • általában jó az emlős fehérjék foldingja és a diszulfid-hidak kialakulása is megfelelő

A rendszer hátrányai:

  • egyes poszttranszlációs módosulások, elsősorban a glikoziláció nem teljesen felel meg az emlősök hasonló módosulásainak; például hiperglikoziláció lép fel, és más oligoszacharid egységek is beépülhetnek a rekombináns fehérjeláncra (pl. mannóz)

  • bizonyos fehérjék heterológ expressziójára nem alkalmas