13.2. Bakulovírus expressziós rendszer

A bakulovírus expressziós rendszernél a gazdasejtek egy molylepke fajból (Spodoptera frugiperda) származnak, a vektor pedig módosított bakulovírus. A bakulovírusok rovarokat fertőző kétszálú cirkuláris DNS-vírusok, pl. Autographa californica és Bombyx mori nukleáris polihedrózis (NPV). Genomjuk kb. 80-100 kbp méretű cirkuláris DNS-ből áll, mely legalább 154 fehérjegént tartalmaz, amiből 20 virális struktúrfehérjét kódol. A vírusrészecskét (virion) egy polihedrin nevű fehérjéből álló mátrix burkolja be, ami biztosítja a vírus túlélését a gazdasejten kívül. A polihedrin burokfehérje a vírus fertőzés kései szakaszában termelődik extrém erős promóterről. Ezzel az erős promóterrel (pPolh) indítjuk el a célgénünk kifejeződését. A transzkripció iniciációjához kulcsfontosságú a TAAG-szekvencia (innen indul a transzkripció), illetve a pPolh promóter és a TAAG között lévő 50 bp-nyi szakasz szekvenciája is erősen befolyásolja az expressziós szintet. Erről a kései promóterről a fertőzés után 20 órával kezd elindulni a génexpresszió, és a sejtek a fertőzés utáni 72-94 óráig még nem lizálnak. A várható legnagyobb expresszió 30-50 h közé tehető, ilyenkor a sejt legaktívabb promótere a polihedrin promóter, s az általa vezérelt heterológ fehérjék mennyisége elérheti az összfehérje tartalom 1-10%-át.

Az expresszió első lépése itt is az expressziós vektor, azaz a rekombináns vírus előállítása. A célgénünket elsőként molekuláris klónozással bevisszük egy transzfer vektorba, amiből az expresssziós kazettánk helyspecifikus transzpozicióval vagy homológ rekombinációval átkerül a vírusgenomba. Majd a célgénünket tartalmazó vírusgenommal megfertőzzük a gazdasejtet, ahol a fertőzés kései szakaszában beindul a génünk kifejeződése. Két módszert fejlesztettek ki eddig a bakulovírus expressziós rendszer hatékony alkalmazására.

13.2.1. „Bac-to-Bac” rendszer

A génünket tartalmazó transzfer plazmiddal (pFastBac) módosított E. coli törzset, ún. DH10Bac törzset transzformálunk. Ez a törzs tartalmazza a vírus genomját (Bacmid), és egy tetraciklin rezisztenciát hordozó segédplazmidot, ami egy transzpozáz enzimet kódol. Miután a DH10Bac felvette a transzfer plazmidot, a transzpozáz segítségével megtörténik a megfelelő helyek között a helyspecifikus transzpozíció, így a célgénünk a vírusgenomba kerül, elkészül a rekombináns vírus. A vírus szaporítását E. coli-ban is végezhetjük, a vektor tehát „shuttle” vektorként szolgál. A rekombináns bacmidot hordozó baktérium telepeket felszaporítás előtt szelektálni kell. Erre a célra antibiotikum és kék- fehér szelekciót alkalmazunk. Transzformálás után a DH10Bac sejteket X-GAL-t, IPTG-t, kanamicint, tetraciklint és gentamicint tartalmazó lemezen szélesztjük. (A transzpozíció után a transzfer vektor gentamicin rezisztencia génje átkerül a vírus genomba, ami eleve már kanamicin rezisztenciát hordozott.) A kék-fehér szelekció azon alapszik, hogy a bacmid hordozza a LacZ azon részét, ami hiányzik a baktérium genomjából (a-komplementáció, ld. 7.2.3.1 . fejezet), de a sikeres transzpozíció hatására ez a kódoló régió tönkremegy, így nem áll össze a sejtben az aktív β-galaktozidáz enzim. A rekombináns bacmidot hordozó baktérium telepek fehérek maradnak. Ezekből a telepekből bacmid-preparátumot készítünk. (Vigyázni kell, mert a bacmid-DNS a plazmidénál legalább 1 nagyságrenddel nagyobb, könnyebben sérül fizikai hatásokra.)

A rekombináns bacmiddal megfertőzzük a gazdasejtet; a gazdasejt lehet SF9, SF21, HiFi5. Először lipofekcióval transzfektáljuk a sejteket. A bacmidot felvett sejtekben idővel kialakulnak a fertőzőképes vírusok, amelyek kijutva a sejtből (bimbózással, vagy kizárással) megfertőzik az összes sejtet. Így a sejtek közel 100%-a tartalmazza és szaporítja a vírusokat. A felszaporított vírusok a transzformálást követő 3-6 napban már a médiumban vannak, ezt hívjuk P1 vírus oldatnak. A P1-et miután centrifugálással és sterilszűréssel mentesítettük a sejtektől, hosszabb ideig hűtőben tárolhatjuk. Ez az oldat még kevés vírust tartalmaz, és kicsi a térfogata, ezért ebből egy több vírust tartalmazó, ún. P2 -t készítünk. A P2 egy P1-nél több vírust tartalmazó sejtmentes médium, melyet nagyobb mennyiségű sejt P1 vírus oldattal  való fertőzésével és inkubálásával kapunk. A vírus mennyiségét további, megnövelt sejtmennyiségű tenyészet fertőzésével növelhetjük, P3, P4, stb. A P3 oldat vírus tartalma már megfelelő a fehérje expresszióhoz. Ezzel fertőzzük a sejteket, majd 36-72 óra között „szüreteljük” (harvesting) a sejteket és izoláljuk az expresszált fehérjénket. Itt is érdemes először kis térfogatban végezni az expressziót, majd 36-72 óra között mintát venni és megnézni termelődik-e fehérjénk (Western-blot). Az optimalizálás során változtathatjuk a hozzáadott vírus oldat (P3) mennyiségét (0,1-10%), és a sejtek összegyűjtéséig eltelt inkubációs időt.

A Bac-to-Bac expressziós rendszer sémáját a 13.2. ábra foglalja össze. Az Invitrogen cég Bac-to-Bac kitjei nagyon megkönnyítik a rekombináns vírusok előállítását, erről itt található bővebb információ.

13.2. ábra: A “Bac-to-bac” expressziós rendszer sémája (a P2 víruspopulációig)

13.2.2. Közvetlen bakulovírus (Direkt Bac) rendszer

Ennél a rendszernél a linearizált deficiens vírus genomba a célgénünk a transzfer vektorból homológ rekombinációval kerül be. Először elkészítjük a rekombináns transzfer vektort, ami tartalmazza a génünk szekvenciáját, majd a linearizált vírus genommal együtt transzfektáljuk a rovarsejteket. A sejten belül létrejön a homológ rekombináció, és csak azok a sejtek tudnak szaporodni, amelyeknél megtörtént a rekombináció, így szelektálni sem kell. A reprodukcióra képes vírusok, mikor kiszabadulnak a sejtből, tovább fertőzik a sejteket, így nő a vírusok mennyisége, amit még tovább lehet szaporítani, vagy fehérjetermeléshez lehet használni. Bővebb információ itt olvasható.

A transzfer vektor szintén szaporítható prokarióta sejtben, lehet benne több vírus is promóter is, így egyszerre több polipeptidláncot is lehetséges expresszálni, pl. BaculoGold vektorok, vagy a PAA cég BaculoOne vektorai. Az expresszióhoz a pPolh promóter mellett egy másik kései promótert, a p10 promótert is használják, amely szintén erős promóter. A bakulovírus expressziós kazetták is tartalmazzák a transzkripcióhoz és transzlációhoz szükséges elemeket: transzkripciós terminációs szekvenciák, poli-A szignál, Kozak szekvencia, N-terminális fúziós címke.

13.2.3. A bakulovírus rendszer előnyei és hátrányai

Az E. coli sejtben rosszul kifejeződő fehérjékre a következő lépés vagy az élesztő, vagy a bakulovírus rendszer. Itt humán fehérjék is kifejezhetők aktív formában. A kitermelés nem lesz soha olyan jó, mint amit el lehet érni egy jól expresszálódó fehérjére E. coli rendszerben, de 1-50 mg fehérje kinyerhető 1 L kultúrából. A fehérje foldingja jó lesz (eukarióta dajkafehérjék vannak jelen), a szekréciós, kompartmentalizációs mechanizmusok működnek. A poszttranszlációs módosítások (foszforiláció, proteolitikus módosítás, glikoziláció, acetilezés, diszulfid-hidak) az emlős rendszerekéhez hasonlóak. Még hetero-dimerizáció is elérhető. Ennek módja ko-infekció, azaz fertőzés egyszerre több vírussal, amelyek különböző célgént tartalmaznak, vagy azt is megtehetjük, hogy a rekombináns vírusba több expressziós kazettát építünk be. A sejtek könnyen fenntarthatók, és gyorsan nőnek szuszpenziós vagy letapadó kultúrában is. Tenyésztésük rázóinkubátort igényel (27-28°C), manipulálásuk pedig steril fülkét és mikroszkópot. Mikroszkóppal követjük nyomon a sejtek állapotát; a fertőzött sejtek megnőnek és lekerekednek. A táp viszont nagyon drága, még az emlőssejtekhez használt bazális (ld. később) táphoz képest is kb. ötször drágább. Másik hátrány lehet, hogy a fertőzőképes vírus oldat előállítása munka és időigényes; szerencsés esetben is a kész transzfer vektortól a P3 vírus oldatig történő eljutásig két hét szükséges.