13.3. Emlős expressziós rendszer

Emlős expressziós rendszer esetén emlős szövetekből származó sejtvonalakban fejeztetjük ki a kívánt génünket. Ennek a rendszernek is a gazdasejt és a vele kompatibilis expressziós vektor az alapja, ami tartalmazza a kifejezendő fehérjénket kódoló szekvenciát. A következőkben összefoglaljuk az emlős expressziós vektor lényeges elemeit, az alkalmazott sejtvonalakat, a génbevitel módját, és az expressziós rendszer előnyeit és alkalmazhatóságát

13.3.1. Emlős expressziós vektorok

Az emlős expressziós vektorok is „shuttle” vektorok; a klónozáshoz és szaporításhoz E. coli rendszert használunk, így a vektornak tartalmaznia kell a baktériumban való fenntartáshoz és szaporításhoz szükséges elemeket; E. coli replikon, antibiotikum rezisztencia gén (ld. 12.2. fejezet). Ezen kívül a transzkripcióhoz szükséges promótert, a mRNS szintézis megfelelő terminációjához és a processzálásáért (poszttranszkripciós módosítások) felelős elemeket, a transzlációhoz fontos szekvenciákat. Ezeket a cisz-reguláló szekvencia elemeket ismertetjük a következőkben. A 13.3. ábrán egy általános eukarióta expressziós vektort mutatunk be.

13.3.1.1. Emlős promóterek és enhanszerek

Az eukarióta promóterek fontos eleme a TATA-box, mely az első átírandó nukleotidhoz képest (5'-irány) -30 és -25 bp-nál található. További, az 5'-irányban elhelyezkedő elemek pl. a -50-től -100-ig elhelyezkedő GC-boxok, melyek száma és elhelyezkedése eléggé eltérő lehet génről-génre, hiányuk, vagy mutációjuk viszont bizonyos gének esetén drasztikusan befolyásolhatja a gén kifejeződését. Ezen elemek vizsgálatára fejlesztették ki a riportergéneket. A riportergént a vizsgálandó promóter/szabályozó elem után fuzionáltatják, majd valamilyen könnyen detektálható módszerrel nyomon követik a kifejeződését. A kifejeződés mértéke arányos a promóter/szabályozó elem működésével. A riportergének olyan fehérjét kódolnak, amelynek aktivitása mérhető (abszorbancia vagy fluoreszcencia alapon). A riportergének fehérje termékeit könnyebb nyomon követni, mint a génről keletkező mRNS-t, ami viszont közvetlenebbül ad információt a promóter aktivitásáról. Az elsők között alkalmazott riportergén a kloramfenikol-acetiltranszferáz (CAT) volt, amely közömbösíti (acetilálással) a sejtek számára toxikus antibiotikumot (azaz egy antibiotikum rezisztencia gén). További riportergének a β-laktamáz-t, β-galaktozidáz-t, luciferázt, valamint a GFP-t és változait kódoló gének.

13.3. ábra: Az eukarióta expressziós vektorok általános felépítése

Általánosan elmondható, hogy az eukarióta gének promótere komplexebb, mint a prokariótáké. Kevesebb bennük a szabályszerűség - sokszor még a TATA-szekvenciák is hiányoznak -, változatosabbak, és rengeteg cisz- és transz-elem befolyásolja a működésüket. Az RNS-polimeráz II sem közvetlenül kapcsolódik a promóterhez, hanem a bazális transzkripciós faktorokon keresztül. Vannak „kötelezőbb” szekvenciaelemek, vannak amelyek génről-génre változnak, sőt olyanok is, amelyek több mint 1000 bp-ra is lehetnek a struktúrgéntől, és mégis jelentősen befolyásolják a génátírást. Ezeket az elemeket hívjuk enhanszereknek (az enhancer szó jelenetése megnövel, megemel). Az enhanszerek lehetnek 5' vagy 3' (upstream vagy downstream) irányban is a gén promóterétől, sőt a gén egy intronján belül is. A távolságuk is változhat, a promótertől akár több ezer bp-ra, de akár más kromoszómán is lehetnek. Működésük lényege, hogy aktivitásuk kifejtésekor térben közel kerülnek ahhoz a promóterhez, amelynek a működését befolyásolják. Az emlős expressziós vektorok ezért a megfelelő mértékű expresszió érdekében az enhanszerek jelentősége miatt nemcsak a megfelelő promótert, hanem annak enhanszerét is tartalmazzák.

De milyen legyen a célgénünk promótere? A válasz abban rejlik, hogy mit szeretnénk vizsgálni. Amennyiben a gén kifejeződését, működését szeretnénk vizsgálni, mindenképpen a saját promóterét érdemes használni, ráadásul a saját környezetében. Ha viszont az a célunk, hogy nagyobb mennyiségben állítsuk elő a génterméket, a fehérjét, akkor nagy expressziót biztosító, erős promótert használjunk. Erre legalkalmasabbak a vírus promóterek, illetve olyan endogén promóterek, amelyek állandóan aktívak és nagy mennyiségű fehérje expressziót tesznek lehetővé. Nézzük meg az emlős expressziós rendszerekben leggyakrabban használt promótereket:

  • SV40 promóter: SV40 (Simian vacuolating virus 40) egy majmokat és az embert is megfertőző DNS vírus. Ezt a polióma családba tartozó vírust Rhesus majom vese sejttenyészet vizsgálata közben fedezték fel 1960 körül, és kiderült róla, hogy számos különféle tumor képződését képes elindítani. A vírus a gazdasejt MHCI receptorán keresztül a VP1 glikoproteinjének segítségével jut be a sejtbe. A sejtmagban a sejt II-es típusú RNS–polimeráz enzime kötődik az 5 kb nagyságú vírusgenom SV40 promóteréhez, és elkezdi átírni a vírus korai génjeit. Ezek a gének két fehérjét kódolnak: kis antigént, és a nagy T-antigént. A nagy T-antigénnek több szerepe is van: kikerül antigénként a sejt plazmamembránjába; szabályozza a virális gének mRNS szintézisét; és kötődik a vírusgenom replikációs origójához, iniciálva ezzel annak replikációját. Az SV40 promóter TATA-szekvenciája, s a tőle 5' irányban lévő GC-boxok és az enhanszer szabályozza a vírus korai, majd a kései génjeinek az expresszióját. (A kései gének a korai gének komplementer szálain találhatók ellentétes leolvasásban; ugyanannak a promóternek a szabályozása alatt, s a GC-boxokhoz kötődő fehérjék döntik el a szintézis idejét és irányát.)

  • CMV promóter (cytomegalovirus immediate-early promóter): a citomegalovírusok a herpesz vírusok családjába tartoznak. Promóterük nagyon erős, nagymértékű expressziót biztosít, ezért is használjuk az expressziós vektorainkban. Állandó kifejeződést biztosít, de a tapasztalatok szerint működése eléggé szövet- és sejtfüggő.

  • CAG promóter: Egy hibrid promóter, amelyben a csirke β-aktin promóterét a CMV korai enhanszerével fuzionáltatták. Ez a promóter a CMV promótertől eltérően nem sejtspecifikus, így bármelyik sejtvonalban használható. Emellett a sejt magas aktin szintje és CMV enhanszer aktiváló hatása miatt erőteljes expressziót eredményez.

  • UbC promóter (human Ubiquitin C): Egy szintén magas szinten expresszálódó, minden sejttípusban kifejeződő promóter. Akkor használják, ha a CMV promóter nem működik.

  • PGK (egér 3-foszfoglicerát kináz 1 promóter): minden sejtben működik a glikolitikus út, ezért ez a promóter minden sejttípusban kifejeződik, csak a kifejeződés mértékében van különbség. Azokban a sejtekben, amelyekben nagyobb a glikolízis sebessége, aktívabb a promóter is, ezért nagy expressziót eredményez. Transzgenikus egerekben és transzdukciós vektorokban használják (ld. később).

  • EF1A (humán elongációs faktor 1α promóter): Szintén akkor használják ezt a promótert, amikor a CMV promóter nem működik (embrionális őssejtek) vagy csökkent az aktivitása.

Az eddig felsorolt promóterek mind konstitutív, erős expressziót biztosítanak, de léteznek ezen kívül szabályozható és indukálható promóterek is.

13.3.1.2. Transzkripció termináció és poliadenilációs szignál

A prokarióta expressziós vektorokban található transzkripció terminációs szekvencia nem feltétlenül szükséges az expresszióhoz, viszont az eukarióta rendszerekben a mRNS megfelelő processzálásához ez a szekvencia esszenciális. Az eukarióta mRNS végét a gén STOP kodonja után következő 3' UTR szekvenciában (3' untranslated region) található elemek jelölik ki. A legfontosabb elem a poliadenilációs szignál, ami az átíródott RNS-en AAUAAA szekvenciának felel meg (ld. 13.4. ábra)

13.4. ábra: A poli-A farok és kialakulása

Ez a konszenzus szekvencia jelzés egy RN-áz komplex számára, hogy a szekvencia után 10-30 bázissal hasítson bele az RNS-be, majd a képződött pre-mRNS így kialakult 3’-végére a poli-A-polimeráz (PAP) szintetizál egy kb. 200 bázisnyi poli-A farkat. A poli-A szekvenciát nem a vektorunk, és nem az inszertünk kódolja, hanem a sejt enzimei helyezik fel a megfelelő poliadenilációs szignál felismerése után. A poli-A szignál, de különösen a poli-A hely körüli szekvenciák is változatosak az eukariótákban. Az alkalmazott eukarióta vektorokban a leggyakoribb az SV40 kései poliadenilációs szignált (SVLPA) és a Herpes simplex virus timidin kináz (HSV-TK) poli-A szignált használjuk, amelyek be vannak építve a vektorunkba. A poli-A farok és a hozzákötődő fehérjék stabilizálják a mRNS-t, ezek nélkül hamar degradálódna. Szerepe van az RNS stabilizálásán túl az érett mRNS citoplazmába való kijutásában és a transzlációban is. A poli-A farok idővel egyre rövidül a sejtben, így egyre csökken a mRNS stabilitása és a transzláció mértéke.

13.3.1.3. Splicing szignál

Az eukarióta gének az 5' és 3' UTR szekvenciák mellett intronokat is tartalmaznak. Az intronok kivágása és a pre-mRNS érése a sejtmagban történik. Csak az érett mRNS jut ki a citoplazmába, ahol elkezdődhet a transzláció, a fehérje szintézise. Minden szabályozó elem, ami segíti a mRNS érését hozzájárul a fehérjénk expressziójának a növekedéséhez. Fehérjetermelés céljából nem a teljes gént, hanem az intron-mentes cDNS szekvenciát szoktuk klónozni az expressziós vektorba, ami így nem tartalmaz „splice”-helyeket. A splice-helyek azonban szerepet játszanak a mRNS érésében, meggyorsítják a mRNS képződésének sebességét. Ezért számos expressziós vektor tartalmaz intron szekvenciákat 5' és 3' splice-helyekkel, ami megnöveli a fehérje expresszió mértékét

13.3.1.4. Transzláció iniciációs (Kozak-) szekvencia

Az eukarióta gén transzlációjánál is nagyon fontos a mRNS szekvenciája az iniciációs kodon környezetében. Ezek a szekvenciák segítik, hogy jól beilleszkedjen az iniciációs Met kodon a riboszóma kötőhelyére. Marilyn Kozak vizsgálta az eukarióta gének transzlációjának iniciációjáért felelős szekvenciákat, és azt találta, hogy vannak bizonyos helyek, ahol fontos, hogy milyen nukleotid található. Vizsgálatainak eredményeként megállapított egy konszenzus szekvenciát, amely nagy valószínűséggel kedvező az iniciációs kodon (AUG) riboszómához való kötődéséhez. Ezt a szekvenciát hívjuk Kozak-szekvenciának. Ezek alapján az iniciációs AUG mellett nagyon fontos, hogy a +4 helyen G, -3 helyen purin bázis (A vagy G) legyen: (gcc)gccRccAUGG. A 12.13. ábrán látható az a szekvencia logó, ami feltünteti, hogy az iniciációs kodon környékén az eukarióta gének milyen nukleotidokat tartalmaznak. Látható az ábrán, hogy az iniciációs kodon a DNS templátban szinte mindig ATG (egyes esetben CTG is lehet helyette), +4 helyen leginkább G található, míg a -3 helyen A vagy G nukleotid. Érdemes tehát a nagyobb expresszió érdekében betervezni a feltehetően erős konszenzus Kozak-szekvenciát. Amennyiben az iniciációs szekvenciák környéke nem elég jó, akkor a riboszóma onnan fogja indítani a transzlációt, ahol erősebb Kozak-szekvenciát talál. Ha N-terminális fúziós fehérjét fejeztetünk ki, akkor a vektor már tartalmaz a fúziós-tag kódoló szekvenciája előtt egy erős Kozak-szekvenciát (ld. 13.5. ábra), amiben megbízhatunk. Ha nincs a vektorban, akkor a gyártó ezt közli velünk, és nekünk kell betervezni.

A Kozak-szekvencia logója

13.5. ábra: A Kozak-szekvencia logója (a konszenzus szekvencia egyes pozíciókban megtalálható nukleotidok gyakorisága)

Az eukarióta gének monocisztronosak, de előfordul, hogy egyszerre két polipeptidláncot szeretnénk kifejeztetni egy promóter irányítása alatt. Ilyenkor policisztronos vektort kell használni, amiben a második fehérjét kódoló szekvencia előtt belső riboszóma kötőhelynek kell állnia. Ezt a szekvenciát hívjuk IRES-nek, azaz angolul internal ribosome entry site-nak. Ebben az esetben a transzláció az 5'-sapka felismerése nélkül indul a mRNS közepéről.

13.3.1.5. Szelekciós markerek

Az emlős sejtek szelektálásának legelterjedtebb módja az antibiotikum szelekció. A szelekciós marker gén (miként a prokarióta sejteknél is) az antibiotikum átalakítását és ezzel közömbösítését végző enzim, amely az expressziós vektorról egy erős emlős promóter irányítása alatt termelődik. A leggyakrabban használt antibiotikum a geneticin vagy G418, higromicin, zeocin és blaszticidin. A G418, egy aminoglikozid-típusú antibiotikum, amely gátolja mind prokarióta, mind eukarióta sejtekben a fehérjeszintézist. Ebbe az antibiotikum családba tartozik még a gentamicin, neomicin és a kanamicin is. Ezek semlegesítését a neomicin gén által kódolt aminoglikozid-3'-foszfotranszferáz (APH) végzi, amely foszfátcsoportokat visz fel az antibiotikumokra, így azok nem tudnak többé kötődni a riboszómához. A higromicin-B is egy aminoglikozid típusú antibiotikum, amely szintén fehérjeszintézist gátol és használható prokarióta, eukarióta sejtekben egyaránt. Közömbösítéséhez higromicin-foszfotranszferáz génre (hpt) van szükség. A hatásmechanizmus azonban ugyanaz, az antibiotikum foszforilálódik, így nem tud többé kötődni a riboszómához. Az antibiotikum szelekció során meg kell keresnünk azt a koncentrációt, amely elpusztítja a nem transzfektálódott sejteket, míg a transzfektált sejtek túlélnek és szaporodnak benne. Antibiotikum szelekció felhasználásával kiválogathatjuk azokat a sejteket, amelyek felvették az expressziós vektort és így rezisztenciát szereztek.

13.3.1.6. Az emlős expressziós vektorok típusai

Az emlős expressziós vektorok legtöbb eleme különböző emlős sejteket fertőző vírus genomból származik, sőt egyes típusoknál magát a rekombináns vírust használjuk génhordozónak. Ez alapján csoportosítva nézzük át a legelterjedtebb emlős vektorokat.

Plazmidok: általában vírus genetikai elemeket használnak bakteriális elemekkel együtt, valamint erős promótereket tartalmaznak, amelyek a legtöbb sejttípusban működnek. Általában nem integrálódnak a gazdasejt genomjába, lehet viszont replikációt biztosító origójuk (SV40, vagy EBV origó).

  • pCDNA: CMV promóter

  • pEGFP-N1: CMV promóter, eGFP fluoreszcens fúziós címke kerül a fehérjénk C-terminálisára.

  • pEGFP-C1: CMV promóter, eGFP kerül a fehérje N-terminálisára (ld. 13.6. ábra). A kívánt génünket CMV promóterrel fejeztetjük ki, SV40 PA terminátor szekvenciával. Mivel ez egy shuttle vektor, prokariótában a replikációját a pBR322 replikon teszi lehetővé; a szelekciót pedig a prokarióta AmpR-promóter vezérelte NeoR rezisztencia gén terméke biztosítja (kanamicin antibiotikumot használva). A rezisztencia gén emlős sejtekben való kifejeződését az SV40 promóter és a TK_PA szignál biztosítja (ilyenkor G418 antibiotikumot használunk). Számos (kb.16) különböző restrikciós hellyel lehet a cDNS-ünket bevinni az eGFP-fúziós címke mögé. Az inszertünket EGFP_C_primerrel tudjuk forward irányból szekvenálni, de más szekvenálás lehetőséget is kínál a vektor.

pEGFP-C1 expressziós vektor térképe

13.6. ábra: pEGFP-C1 expressziós vektor térképe. A vektor térképet az Addgene Vector Database készletéből töltöttük le. Ez egy szabad vektor megosztó központ, amely lehetőséget teremt a kereskedelmi forgalomban nem lévő vektorok csere-beréjére minimális kezelési költséggel, valamint a saját vektorunk térképét is el tudjuk készíteni.

Léteznek olyan vektorok is, amelyek a GFP különböző variánsait kódolják fúziós címkeként, pl. YFP, CFP; vagy más fluoreszcens fehérjét (mCherry, DsRed). Ezek a fúziós címkék más-más hullámhosszú fénnyel gerjeszthetők, és máshol van az emissziójuk. Segítségükkel a fehérjénk expresszióját, az eukarióta sejten belüli lokalizációját (kololakizációját) könnyen nyomon tudjuk követni. Egy ilyen kísérlet eredményét mutatja be a 13.7. ábra.

Fehérje expresszió nyomonkövetése fluoreszcens fúziós címkével

13.7. ábra: Fehérje expresszió nyomonkövetése fluoreszcens fúziós címkével. HEK293T sejteket transzfektáltunk egyszerre két különböző fluoreszcens címkét hordozó plazmiddal (kotranszfekció), majd transzfekció után 36 órával floureszcens mikroszkóppal követtük a plazmidokban kódolt fehérjénk expresszióját. Az első képen látható, hogy a sejtek kifejezik CFP-címkét hordozó fehérjét (gerjesztés: 456 nm, emisszió: 486 nm), a második képen pedig a YFP-fehérjét kifejező sejtek világítanak piros színnel (gerjesztés:510 nm, emisszió:535 nm). A harmadik ábrán egymásra vetítettük a két képet, így látható, hogy a narancssárga sejtek felvették mindkét plazmidot. Ez a módszer alkalmas in vivo fehérje kolokalizáció vagy kölcsönhatás kimutatására.

Rekombináns vírusok: nagy hatékonyságú, replikáció-inkompetens virális részecskék. Ezek a rendszerek használhatók fehérjék expressziójára, vagy géncsendesítési kísérletekre is. A génterápiában is a rekombináns vírus rendszereket használják.

  • SV40: 5 kbp nagyságú genom, kb. 5 kbp nagyságú inszertet tud befogadni, transzdukáló vektor, de speciális gazdasejt kell hozzá, pl. CV-1 vagy COS sejtek.

  • Papillomavírus: 8 kbp nagyságú cirkuláris kétszálú DNS vírus. Stabil extrakromoszomális a replikációja, 20-50 kópia/sejt.

  • Retrovírusok: RNS-vírusok, pl. Rouse szarkóma (RSV), egér leukémia (MLV), egér emlőtumor (MMTV) vírusok. Integrálódnak a gazdasejt genomjába, stabil transzfekcióra, ezáltal permanens expresszió képesek.

  • Adenovírusok: 36 kbp nagyságú genom, extrakromoszomális a replikációjuk, tranziens expesszióhoz, génterápiához használják.

  • Lentivírus: RNS-vírus, stabil integráció a genomba, permanens expresszióra alkalmas.

13.3.1.7. Stabil vagy tranziens transzfekció

Az expressziós vektorok másik csoportosítása azon alapul, hogy képes-e a vektor, vagy valamely része integrálódni a gazdasejt genomjába, s ezzel stabil klónokat létrehozni. Ezeket a vektorokat hívjuk (ld. élesztőnél) integrálódó vektoroknak. Az integrálódó vektorból általában homológ rekombinációval történik meg az expresszálandó fehérjénk szekvenciájának beépülése a gazdasejt genomjába. Ennek a folyamatnak a hatásfoka nagyon kicsi, ezért mindenképpen szelektálni kell szelekciós markerek segítségével. A szelekciót hosszabb ideig fenn kell tartani, így közel 100% lesz a transzformálódott sejtek mennyisége. A stabilan transzfektált sejtek már egy önálló sejtvonalat alkotnak és fenntarthatók, lefagyaszthatók. Előnyük a homogenitás, a stabilitás (nem vész el a transzgén), illetve a nem túl magas expressziós szint. A nem túl magas expressziós szint sokszor előnyt jelent, mert kevésbé „szól” bele a sejt normál működésébe, és nem pusztul el a sejt. Tranziens transzfekciónál sok fehérje termelődik, ez jelentősen befolyásolja a sejt működését, ami stresszt jelent a sejtnek és ez sokszor problémát okoz. A tranziens transzfekció előnye viszont, hogy nagyon gyors, a transzfekció után 12-72 óra elteltével már lehet vizsgálni a sejtet, vagy izolálni a kifejeződött fehérjét.

A transzfekció hatásfokát és a fehérje kifejeződését fúziós fehérjékkel lehet nyomon követni. Ilyenkor N- vagy C-terminálisan egy enzimaktivitással (luciferáz, β-laktamáz, β-galaktozidáz ) rendelkező fehérjével vagy fluoreszcens fúziós fehérjével együtt fejeztetjük ki a fehérjénket, ezáltal detektálhatjuk az expresszió mértékét, hatásfokát (a sejtek hány százaléka transzfektálódott), valamint a kifejeződő fehérje lokalizációját.

A tranziens transzfekció előnye a gyorsaság és a magas expressziós szint, így kiválóan alkalmas fehérje termelésre, illetve nagyszámú különböző fehérje vizsgálatára. 3-4 nap múlva viszont a sejt vagy elpusztul a nagy expressziós szinttől, vagy annyira „kihígul” benne az expressziós vektorunk, hogy jelentősen lecsökken a transzformált sejtek mennyisége. Ennek oka, hogy a vektorunk nem replikálódik, így mitóziskor kihígul, vagy degradálódik. Ennek kiküszöbölésére használhatunk replikatív episzomális vektorokat, mint pl. a pSV-vektorok. Ezek a vektorok virális replikációs origót hordoznak, és ha a sejtben kifejeződik a replikációt szabályozó fehérje is, akkor a vektorunk extrakromoszomálisan fog replikálódni. Ennek következtében kevésbé hígul ki, ráadásul antibiotikum szelekciót alkalmazva még fel is lehet dúsítani a transzfektálódott sejteket. Ez egy köztes megoldás az átmeneti és a stabil transzfekció között, azaz a sejtvonal szelektálható és fenntartható hosszabb ideig, de nem stabil. Az antibiotikum rezisztenciát, amit a szelekciónál kihasználunk, bejuttathatjuk ugyanazon a vektoron, ami a kívánt fehérje cDNS-ét hordozza, de egy másik expressziós vektoron is. Ilyenkor együtt transzfektálunk a két plazmiddal, azaz ko-transzfektálunk, s azzal a feltevéssel élünk, hogy ha egy sejt felvette a szelekciós markergént tartalmazó plazmidot, akkor nagy valószínűséggel felvette a másikat is.

13.3.2. Sejtvonalak

A fehérje expresszióra használt sejtvonalakat primer sejttenyészetekből nyerik, többszörös passzálás után. A kiindulási szövet lehet nem transzformált felnőtt szövet, azonban az ezekből származó sejtek csak ~30 osztódást bírnak ki. Lehet normál embrionális szövet, amelyből származó sejtek ~50 alkalommal képesek osztódni. Ezeket a sejttenyészeteket tehát nem lehet korlátlan ideig fenntartani. Expressziós kultúraként használnak még daganatos sejtekből kivont immortalizált, vagy mesterségesen immortalizált sejtvonalakat is. A mesterségesen immortalizált sejtvonalakat vírus általi fertőzéssel lehet előállítani, ilyen például a COS1 és a COS7 sejtvonal. Ezeket transzformált sejtvonalaknak hívjuk, és előnyük, hogy korlátlan ideig képesek osztódni. A nem transzformált sejtvonalak is idővel spontán transzformálódnak, így korlátlan ideig fenntarthatóvá válnak. Ennek oka, hogy nincs immunrendszer, ami „kordában tartaná” őket, és gyorsan mutálódnak, szelektálódnak az in vitro körülmények hatására.

A leggyakrabban használt sejtvonalak:

  • CHO: (Chinese hamster ovary) kínai csíkos hörcsög petefészek sejtek; monolayer kultúrában (letapadva) tarthatók, gyorsan nőnek és hatékonyan termelik a rekombináns fehérjét; az emlős sejtek „kólija”. Az ipari termelésre leggyakrabban használt emlős expressziós rendszer.

  • COS: afrikai zöld majom veséből származó fibroblaszt-szerű sejtvonal, amelyet CV-1 sejtek SV40 vírussal való fertőzésével nyerték. (A CV-1 sejtek afrikai zöld majom vese fibroblaszt sejtek.) Gyakran használják rekombináns fehérjék előállítására. Amennyiben SV40 vektorral fejeztetjük ki a fehérjénket, a vektor replikációját a nagy T-antigén szabályozza, így önállóan replikálódik.

  • NIH-3T3: egér embrionális fibroblasztból származó, letapadó (monolayer kultúra) immortalizált sejtvonal.

  • HeLa: a legrégebben fenntartott humán sejtvonal, méhnyakrák sejtekből származik (Henrietta Lack amerikai nő tumorjából 1951-ben vették ki az eredeti sejteket). Rendkívül gyorsan osztódó letapadó sejtvonal, a rákkutatás leggyakrabban használt sejtvonala.

  • L6: patkány vázizomból izolált sejtvonal

  • HEK293: embrionális vesesejtekből származó immortalizált sejtvonal. Normál embrionális vesesejteket fertőztek adenovírussal, amelynek genomja integrálódott a sejt genomjába. Nagyon könnyen fenntartható, és transzfektálható. Előszeretettel használják sejtbiológiai kutatásokban és biotechnológiában terápiás fehérjék és vírusok előállítására. A HEK293T sejtekben kifejeződik az SV40 nagy T antigén, így SV40 replikációs origójú expressziós vektort használva sokáig fenntartható a vektor replikációja és így a fehérje expresszió is.

A megfelelő körülmények között tartott sejtek viszonylag gyorsan osztódnak, így könnyen változhat a geno-és így a fenotípusuk. Ügyelnünk kell arra, hogy ne változzon a genotípus a kísérleteink során (ugyanazzal a sejttel kezdjük és fejezzük be a kísérleteinket), ezért mindig fagyasszuk le a kultúrát, mikor először kézhez kapjuk a sejteket. Így bármikor visszanyúlhatunk az eredeti, ismert genotípusú kiindulási sejthez. Ehhez be kell tartani a fagyasztás és a felolvasztás szabályait, és meg kell találni a sejteknek a legmegfelelőbb fagyasztási médiumot. Általában jellemző, hogy a fagyasztást magas szérum (20-40%), és kb. 10% DMSO mellett végezzük. A fagyasztás lassan történik, míg a felolvasztás gyorsan és utána gyorsan meg kell szabadulni a DMSO-től, mivel könnyen átjut a plazmamembránon, és toxikus hatású a sejtekre.

13.3.3. Génbevitel emlős sejtbe

Az expressziós vektor bevitele a sejtekbe biokémiai, fizikai módszerekkel és vírusfertőzéssel történhet. Ezekkel a módszerekről a 3. fejezetben foglalkoztunk részletesen. Az emlős sejtekhez használt génbeviteli lehetőségek összefoglalva:

  • DEAE-dextrán-mediálta transzfekció

  • transzfekció Ca2+-foszfátos/DNA csapadékkal

  • kationos-lipofekció

  • elektroporálás

  • transzdukció

  • mikroinjektálás

Nagyon fontos a beviendő gén tisztasága. Minél tisztább és töményebb a rekombináns DNS, annál nagyobb a transzfekció hatékonysága. Általában a szilika oszlopos tisztítás elegendő (kaphatók nagytisztaságú, mikoplazmamentes DNS-t ígérő kitek is), de még jobb hatásfok érhető el alkoholos-lecsapás után, illetve CsCl-os gradiens centrifugálással.

13.3.4. Indukálható emlős expressziós rendszerek

Minden expressziós rendszernél nagy előnyt jelent, ha a kívánt gén (target vagy célgén) expresszióját szabályozni, indukálni lehet. Ez különösen akkor jó, ha a termelendő fehérje toxikus, vagy erősen befolyásolja a sejt működését. Az emlős expressziós vektorok indukcióját különösen a transzgenikus állatok esetében használják ki. Ennek egyik módja, ha a génünk promóterébe olyan elemeket építünk, amelyek a megfelelő faktorok megkötése után a gén transzaktivációját idézik elő. Ezek az elemek lehetnek a gazdasejtben már eleve megtalálhatóak, vagy mesterségesen bevittek is. (bakteriális, más eukariótából származó elemek). Az alábbiakban néhány példát sorolunk fel:

· Glükokortikoid hormon hatására aktiválódó elem, GRE (glucocorticoid response element): A hormon válasz elemek vagy angolul Hormon Response Element(HRE) nagyon elterjedtek a humán genomban, több száz található belőlük és nagyon fontos folyamatokat szabályoznak. Működésük a következő: a megfelelő hormont megköti a sejtben található receptora, ezután a receptor-hormon komplex dimerizál és transzlokálódik a sejtmagba. Itt hozzákötődik a DNS-en található megfelelő HRE konszenzus DNS-szekvenciájához, majd kölcsönhatásba lép a promóterhez kötődő más transzkripciós faktorokkal és elindítja a target gén transzkripcióját. Ilyen HRE a GRE is, amelyet különböző szteroid-hormon receptorok képesek felismerni, majd hozzákötődve transzaktivációt elindítani. Indukálható expressziós vektorokban adenovírus „late” promóterben GRE szekvenciákat helyeznek el a megfelelő módon, amely a hormon, vagy származékainak a hatására a promóter után kapcsolt gén expresszióját akár 1000-szeresére is növelheti. Érthető, hogy azok a sejtek mutatnak nagyobb génexpressziót, amelyek több hormon receptort tartalmaznak. Ezért a gazdasejt egy glükokortikoid receptor túltermelő sejt (pl. CHO), amelyet dexametazonnal indukálnak a megfelelő génexpresszió érdekében.

  • Ekdizon-indukció: Az ekdizon egy ízeltlábú „hormon”, amely nagy szerepet játszik az állat egyedfejlődésében, és ekdizon válasz elemeken („response factor”) keresztül képes szabályozni bizonyos gének kifejeződését. Emlőssejtek indukciója esetén be kell vinni ezeket az elemeket és külön a receptort is be kell építeni a promóterbe. Így az indukció két vektorral oldható meg:

    1. vektor: HSP promóter + ekdizon response elem + inszert

    2. vektor: CMV és RSV promóter + ekdizon receptor kódoló régió

  • Bakteriális elemmel is lehet emlőssejtekben indukált génexpressziót elérni, méghozzá a jól ismert lac-operátor segítségével. Az indukció IPTG-vel történik, de meg kell oldani az operátor és a lac-represszor fehérje szekvenciájának a bevitelét a sejtekbe, ami általában szintén két vektor használatával oldható meg:

    1. vektor: RSV-LTR promóter + lac operátor (3x) + inszert

    2. vektor: CMV promóter + lacI

  • Tetraciklin indukció: A tetraciklin nagyon hatásos antibiotikum Gram-pozitív, Gram-negatív baktériumok és protozoák ellen is. Legalább 1000 származékát állították elő és ismert a hatásmechanizmusa is. Könnyen bejut a prokarióta sejtekbe, ott hozzákötődik a riboszómához és tönkreteszi a kodon-antikodon kölcsönhatást. A rezisztens baktérium egy multimer antiporter fehérjével (Tet) kipumpálja az antibiotikumot a citoplazmából. Számos Tet fehérje létezik, többek között a Tn10 transzpozon által kódolt TetA. A TetA nagy mennyisége esetén, mivel a fehérje működése közben kationokat pumpál ki a sejtből, a membrán depolarizálódik, ami a sejt pusztulásához vezethet. Ezért a sejt erősen szabályozza a TetA expresszióját egy TetR represszor fehérjével. Tetraciklin hiányában a TetR erősen kötődik a tetA és tetR gének operátor szekvenciáihoz, meggátolva a fehérjék expresszióját. Tetraciklin hatására azonban a TetR leválik az operátorhelyről és beindul az expresszió. Ez utóbbi indukciós rendszert részletesen is ismertetjük (ld. 13.3.4.1. )

13.3.4.1. A Tet-represszoron alapuló indukciós rendszerek

A Tet operon működését kihasználva fejlesztettek ki több frappáns és széles körben használt indukálható emlős expressziós rendszert. A szabályozott rendszer előnye, hogy az elemei bakteriálisak, tehát nem interferálnak a gazdasejttel. Ezekben a rendszerekben a célgén transzkripcióját a TetR szabályozása alá helyezik úgy, hogy néhány kópiában tetO (operátor) szekvenciák találhatók a promóter és a transzkripció kezdőhelye között. Így tetraciklin (vagy származékai) nélkül nincs expresszió. Megfelelő szövetspecifikus promóter és a tetO elem kombinációjával szövetspecifikus és indukálható génexpresszió érhető el. Ez az ún. Tet-represszor rendszer jól működik transzgenikus növényekben, de kevésbé sikeres emlőssejtekben. Ennek oka, hogy emlőssejtekben nem elég nagy a represszor koncentrációja, ami gátolni tudnál az erős promótert.

Kreatív kutatók elkészítették az előbbi rendszer a fordítottját, ahol a TetR nem represszor, hanem aktivátor lesz. Először fuzionáltatták egy transzaktivátor fehérjével, a HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1) VP16-tal, így mikor a represszor köt a promóterhez, akkor a transzaktivátor fehérje génátírást indít el. Amennyiben megjelenik a sejtben az effektor (tetraciklin), akkor a VP16-TetR transzaktivátor (tTA) kiméra leválik a promóterről és jelentősen lecsökken a génátírás. Ez a rendszer akkor működik jól, ha stabil transzfekció során a transzaktivátor és a target gén több kópiában van jelen a genomban. A tTa rendszerben tehát akkor indul el a génátírás, ha nincs a sejtben tetraciklin, ezért ezt Tet-Off rendszernek is hívják. Az indukálatlan állapot fenntartásához alacsony-közepes koncentrációban kell az effektort (tetraciklin, doxiciklin) adni a sejtekhez.

Később a rendszert megfordították, s ebből alakult ki a mutáns TetR fehérjével, ahol a represszor csak az effektor jelenlétében indítja el az expressziót, annak hiányában nem. Ez a Tet-On rendszer sokkal érzékenyebb doxiciklinre és anhidro-tetraciklinre, mint tetraciklinre. A rendszer jól működik ebben a formában is, de még továbbfejlesztették az expressziós szint növelése és az állandóan termelődő tTa toxikus hatása miatt. A vad-típusú tTa kiméra represszor fehérjét is a tetO elem szabályozása alá tették, így az effektor nemcsak a target gén, hanem a tTA gén expresszióját is szabályozza: antibiotikum jelenlétében alacsony a szabad tTa szintje, így nem tud kötődni az operátorhelyre, nincs génátírás. Mikor nincs jelen az antibiotikum, akkor viszont hozzákötődik és elindítja önmaga és a target gén szintézisét. Ráadásul minél több tTA termelődik, az annál jobban indukálja önmaga és a target gén termelődését. Ezt a rendszert autoregulátor Tet rendszernek hívjuk.

Számos biotechnológiai cég kínál tetraciklin regulálta emlős expressziós rendszert. Például az Invitrogen T-Rex rendszere Tet-On rendszer, tehát tetraciklin és származékaira kapcsol be az expresszió. Bővebben itt lehet olvasni róla. A Tet-On és Tet-Off rendszer sémáját a 13.8. ábrán mutatjuk be.

13.8. ábra: A Tet-On és Tet-Off rendszer sémája