13.4. Egyéb eukarióta expressziós rendszer

13.4.1. Dictyostelium discoideum expressziós rendszer

A Dictyostelium discoideum egy sejtes nyálkagomba. A talajban él, többnyire baktériumokkal táplálkozik. Laboratóriumban könnyen tartható akár folyadékkultúrában, akár szilárd táptalajon. Rövid az életciklusa, a genomja (34 Mbp haploid genom, 6 kromoszóma, 12500 fehérje gén) teljesen ismert, sok génje homológ humán génekkel, a gének szabályozása is hasonlóan történik. Génjeinek szekvenciája a DictyBase adatbázisban található. Nagyon jó modell organizmus genetikai, sejtbiológiai folyamatok tanulmányozására, de a rákkutatásban, immunfolyamatok megértésében is nagy hasznát veszik.

A rekombináns fehérje expressziójához itt is „shuttle” vektorral visszük be a kívánt fehérjénk cDNS-ét a gazdaszervezetbe. A vektor tartalmazza a baktériumban történő szaporodáshoz szükséges elemeket (origó, rezisztencia gén), és a Dictyostelium sejtben történő replikációért felelős szekvenciákat. Ennek az eukarióta élőlénynek is van természetes plazmidja, aminek a replikációs origóját használják ki az expressziós vektorok. Az élesztőhöz hasonlóan vannak integrálódó és replikálódó expressziós vektorai. A Dictyostelium expressziós rendszert leginkább a citoszkeleton és fehérjéinek tanulmányozására használják. Kiválóan alkalmas rekombináns miozin fragmentumok előállítására. Amennyiben a rekombináns fehérje sejtbiológiai szerepét vizsgálják, akkor GFP-fúziós címkével látják el, fehérje preparálás céljából pedig a szokásos affinitás címkékkel (pl. His, GST, Flag). A pDXA-3H sorozat plazmid vektorokat kimondottan fehérje expresszióra dolgozták ki.

13.4.2. Drosophila melanogaster expressziós rendszer

A gyümölcslégy (Drosophila melanogaster) Schneider 2 sejtek (S2) 20-24 órás lárva primer sejttenyészetből származnak. Könnyen kezelhetőek, nem igényelnek széndioxidot, 25-28°C-on letapadó és szuszpenziós kultúrában egyaránt könnyen szaporíthatók. Kiválóan alkalmasak tranziens és permanens heterológ fehérje expresszióra. A sejtek transzfektálása általában kationos-liposzómás (Cellfectin) vagy Ca2+-foszfátos módszerrel történik. Tranziens transzfekciónál 1-4 nap múlva lehet vizsgálni a transzfektált sejteket, vagy izolálni az expresszált fehérjét. Stabil (permanens) transzfekciónál szelektálni kell a megfelelő antibiotikum rezisztens klónokat. Szelekcióra leggyakrabban higromicin és blaszticidin antibiotikumot használnak, melyek eukarióta és prokarióta sejtekre egyaránt toxikusak. A blaszticidin közömbösítésére használt rezisztencia gént (blaszticidin-S-dezamináz, bsd) a pCoBlast nevű plazmid, míg a higromicin rezisztencia gént (hpt) a pCoHygro plazmid kódolja. Mint a névből is látszik, a rezisztencia gént az expressziós vektorral való ko-transzfekcióval állítják elő. A stabil sejtvonal létrehozása 2-4 hetet vesz igénybe. A stabil klónok eltarthatóak, le lehet őket fagyasztani. Az expresszált fehérje mennyiség viszonylag magas (1-20 mg/L kultúra). Az emlős szervezetekben található glikoziláció és a megfelelő diszulfid-hidak kialakulnak. A szekréció működik mind az inszert saját, mind a vektor BiP-szignáljával. Használható akár virális fehérjék, akár humán fehérjék előállítására, transzkripciós faktorok, vagy nem Drosophila-homológ transzkripciós faktorok tanulmányozására

Drosophila expressziós vektorok: a vektoroknak hordozniuk kell az eukarióta vektorok kötelező elemeit (promóter, poliA szignál, Kozak szekvencia, stb.), illetve mivel szintén „shuttle” vektorok, a megfelelő bakteriális elemeket is. Néhány példa: pMT/V5-His (metallotionein promótert tartalmaz, amely fémionokkal indukálható), pCoBlast és pCoHygro vektorok (rezisztencia gént kódolnak egy erős, konstitutív promóter)