13.5. Eukarióta sejttenyésztés

A sejttenyészetek manipulálását steril körülmények között kell végezni. Erre alkalmas a lamináris fülke, mivel nagyon kis csíraszámú légteret biztosít (ld. 13.9. ábra). A tenyésztéshez használt edényeknek és eszközöknek megbízhatóan sterilnek kell lenniük. Ezért előre csomagolt, általában ionizáló sugárzással sterilizált tenyésztőedényeket, szerológiai pipettahegyeket használunk. Ha erre nincs mód, pl. nagy léptékű szuszpenziós kultúránál, vagy nagyon kis térfogatok kiméréséhez pipettahegyre van szükség, akkor többszöri vízgőz-sterilizálást használunk (20 perc, 121°C, 2 atm nyomás). A laboratóriumban lévő felületeket tartsuk tisztán, fertőtlenítsünk gyakran. A sterilfülkét használat előtt és után törüljük át 70%-os alkohollal (etanol, izopropanol), használjunk gumikesztyűt magunk és a sejtek védelmében is.

13.9. ábra: Munka a sterilfülkében

Alapvetően kétfajta tenyésztési mód létezik; szuszpenziós kultúra és letapadó (monolayer) sejttenyészet. Egyes szuszpenziós kultúrákat állandóan rázatni kell, pl. Sf9 és élesztő sejtek. Az élesztő sejtek nevelése egyszerű, hasonló a bakteriális sejtekéhez. A táptalaj összetétele egyszerű, általunk is összeállítható. A rovarsejtek és az emlőssejtek azonban általában drága, komplex táptalajt igényelnek. Jobban járunk, ha megvásároljuk őket a megfelelő gyártótól. Nekünk csak antibiotikumot, táptól függően L-glutamint, és szérumot kell beletenni használat előtt.

Az alap vagy bazális táptalajokat kevésbé igényes sejtekhez használjuk, pl:

A komplex médiumok több komponenst is tartalmaznak, magasabb igényhez igazodnak, ilyen pl. az RPMI1640: nagyon sok sejtféleséghez használható.

A táptalajok pufferolt (bikarbonát-HEPES rendszer, pH 7,2-7,4) körülmények között aminosavakat (esszenciálisakat, vagy az összeset), szervetlen sókat (Na+, K+, Mg2+, Ca2+), nyomelemeket (Fe, Cu, Zn szerves vegyületek formájában), vitaminokat, D-glükózt (esetleg fruktóz, galaktóz, mannóz formájában) és a megfelelő pH nyomon követésére fenolvörös sav-bázis indikátort tartalmaznak, amihez még szérumot adhatunk. A szérum tartalmazza a sejtek túléléséhez és szaporodásához szükséges növekedési faktorokat és hormonokat. Bizonyos sejtek beérik felnőtt marha/ló vérszérummal, igényesebbeknek magzati szarvasmarha (borjú) szérumra van szükségük (FBS: Fetal Bovine Serum), sőt néhány humán sejt fenntartásához emberi vérsavóra van szükség. A vérszérum tartalmaz még zsírsavakat, lipideket, szállítófehérjéket az ionok és hidrofób molekulák számára (pl. transzferrin a vas számára). A szérum (minimum 5-20%-ban) bizonyos sejteknek esszenciális, de jelenléte minden sejtnek kedvező. Végül igen fontos, hogy a médium tartalmazzon antibiotikumot. A fertőzések elkerülésére általában penicillint és sztreptomicint (Pen-Strep 0,5-1%-ban) adunk a médiumhoz, de használhatunk gentamicint, és (ritkábban) antimikotikumot is.