14. fejezet - Célzott génmódosítás (gén-targeting) módszerek

Tartalom

14.1. Bevezetés
14.2. DNS hibajavítás és homológ rekombináció
14.3. Gén-targeting konstrukciók előállítása
14.3.1. A recombineering alapjai. A Red rekombinációs rendszer
14.3.2. Gateway klónozás
14.3.3. Targeting vektorok tervezése
14.3.4. A gén-targeting konstrukciók elkészítése
14.4. A targeting-konstrukció bejuttatása a célszervezetbe
14.4.1. Sejtek és sejtvonalak transzfektálása. Emlős embriók manipulációja
14.4.2. Stabil transzfekció. Transzgének célzás nélküli bevitele
14.4.3. Növényi és gomba sejtek transzformálása. Homológ rekombináció növényekben
14.4.4. Növények genetikai módosítása Ti plazmid segítségével
14.5. Knock-out és knock-in technikák
14.5.1. Homing endonukleázok. Cre/Lox és Flp/Frt rendszerek
14.5.2. Célszekvenciára tervezett hasító enzimek. Cink-ujjas és TALE-nukleázok
14.5.3. Génkiütési technikák (knock-out) és új gének célzott beépítése (knock-in)
14.5.4. Feltételes génkiütés, génjavítás
14.5.5. Genetikai elemek beépítése transzpozonok segítségével
14.6. Géncsendesítés (knock-down) RNS interferenciával
14.7. Stabil episzomális rendszerek
14.8. További olvasnivaló a fejezethez

14.1. Bevezetés

Az eddigi fejezetekben megismerkedtünk a géntechnológia sokféle módszerével. Az eddig leírt módszerek azonban az élő rendszer egészét tekintve csak korlátozott alkalmazásokat tesznek lehetővé. Plazmidokkal és egyéb kívülről bevitt, genetikailag nem stabilelemekkel nem lehet a legtöbb organizmus saját, belső működését tartósan megváltoztatni. Ehhez olyan technológiákra van szükség, amelyek lehetővé teszik az élőlények saját génjeinek DNS-szintű átalakítását. A genomiális DNS módosítása viszont minden tekintetben sokkal nehezebb, mint - a viszonylag kicsi - plazmidok és mesterséges kromoszómák szabása-varrása. A legnagyobb probléma a kromoszómákmérete. Egy sok megabázis (millió bázispár) vagy esetleg gigabázis (milliárd bázispár) méretű DNS-szekvenciában nem tudunk kellően rövid, de mégis egyedi szekvenciákat találni. A hagyományos, restrikciós endonukleázokon alapuló technikák itt egyszerűen csődöt mondanak. Tehát a kromoszómák DNS-ének módosításához teljesen más, újszerű módszereket kell használnunk. Ezek nem 5-10 bázispár szekvenciájának azonosságára épülnek, hanem jóval hosszabb darabokra, motívumokra. A másik probléma a genomiális gének és kromoszóma-darabok fizikai mérete: egy-egy ekkora makromolekula manipulálása, és bejuttatása a sejtbe önmagában hatalmas kihívást jelent. Ezen problémák még ma sem teljesen megoldottak, de a genom-szintű módosító módszerek évről-évre fejlődnek, s mint látni fogjuk, az alkalmazások egész tárházát nyitják meg a molekuláris biológia számára. A "gene-targeting" kifejezést (magyarul célzott génmódosításnak fordíthatjuk) itt most tág értelemben használjuk: beleértjük exogén DNS-darabok, vagy egész gének bejuttatását a genomiális DNS-be spontán integrációs mechanizmusok révén is.