14.2. DNS hibajavítás és homológ rekombináció

Hogy megértsük a genomiális DNS-módosító eljárások működését, előbb a DNS-hibajavítás mechanizmusait kell áttekintenünk. Az örökítőanyagban sokféleképpen keletkezhet hiba, ennek megfelelően számos mechanizmus létezik a kijavításukra is. Az egyszerű bázis-cseréket viszonylag könnyű kijavítani. Attól függően, hogy a bázis kémiai módosulásáról, hidrolíziséről vagy egy (a replikációs során keletkező) hibás beépülésről van szó, különféle bázis vagy nukleotid kivágó (excíziós) mechanizmusok állnak rendelkezésre. Ha a DNS-dimer egyik felében a cukor-foszfát gerinc "eltörik" (hidrolizál), akkor ezt egy megfelelő DNS-ligáz enzim könnyedén helyre tudja állítani. Más a helyzet, ha néhány nukleotid távolságon belül mindkét lánc eltörik. Ilyenkor a hőmozgás következtében már néhány msec elteltével igen messze kerülnek a szabad végek egymástól. Ahhoz, hogy ilyenkor is helyre lehessen állítani a DNS-t, összetett javító enzim-rendszerekre van szükség. Először is az összetartozó végeket (hosszas kereséssel) meg kell találni, utána pedig lehetőség szerint hiba nélkül egyesíteni kell őket.

A kettős törések utáni javításra is többféle in vivo mechanizmus áll a sejt rendelkezésére. A géntechnológiai alkalmazásai miatt a két legfontosabb útvonalról részleteiben is kell beszélnünk. Az egyik a nem-homológ vég-a-véghez illesztés (NHEJ: Non-homologous end joining). Ilyenkor a következőről van szó: ha a két „törvéget” (eredetileg a csonttörésekre használt kifejezés) meg tudja találni az enzimkomplex és azok tökéletesen illeszkednek, akkor az NHEJ javító rendszer DNS-ligáz aktivitása révén egyesíteni fogja őket. A nem-homológ hibajavítást (ami sok baktériumban eléggé alárendelt, de emlősökben domináns szerepű) a bázispárosodások vezérlik. Amennyiben erre nincs mód (pl. tompa véggel vált szét egymástól a két DNS vég, vagy a nukleotidok kémiailag megváltoztak), akkor más mechanizmust kell választani. Ilyenkor elkezdődik a törvégek 5' szálának visszavágása, megfelelő exonukleázok által. Még mindig van lehetőség nem-homológ egyesülésre (MMEJ: Microhomology-mediated end joining), de a tökéletes javítás csak a végek egyesítésével ilyenkor már nem lehetséges. Minden remény azonban nem veszett el. Ha a sejtnek sikerül egy megfelelő, ép kettős szálú DNS templátot találnia a javításra, akkor kipótolhatja az elveszett szakaszokat, és hibátlanul helyreállíthatja a sérült molekulát. Ez az alapja a homológ rekombinációnak (ld. 14.1. ábra).

14.1. ábra: DNS kettőstörések javítása: nem homológ „vég-a-véghez” illesztés és homológ rekombináció

Ilyenkor a törvégeket felismerő fehérjekomplex előbb hosszan széttekeri a DNS-t, és lebontja az 5'- végű szálat. Az egyszálú DNS-t erre specializált fehérjék burkolják be, hogy lineáris maradjon. Ezzel egyidejűleg elkezdődik a homológia-keresés. Ha sikerül egy, a törvéghez hasonló szekvenciájú kettős szálú DNS-t találni, akkor azt a megfelelő fehérjék széttekerik, és a törött 3' szál benyomul az ép párjának a helyére (strand invasion). Ez után a DNS-polimeráz segítségével megkezdődik a sérült szál kiegészítése. A rekombinációs pont mögött a négy DNS-szál egy furcsa, "vasúti keresztváltóra" emlékeztető kereszteződést alkot (Holliday junction). Miután minkét szál megtalálta a homológ párját, elegendően hosszú szintézis után az összes nukleotid visszapótlódik. DNS-ligázok ezután bezárják a nukleotidszálak cukor-foszfát gerincét. Marad azonban egy kis probléma: a két kromoszóma két helyen még mindig kereszteződik egymással. Ezen pontok feloldására speciális reszolváz enzim áll rendelkezésre (Holliday junction resolvase). A reszolváz elvágja a négyes DNS-t majd átellenben egyesíti, ezáltal két külön párt hoz létre.

A kereszteződések egyébként a keletkezésük után vándorolhatnak is: ez segíthet akkor, ha csak az egyik 3'-vég találta meg a homológját. A hibrid ilyenkor szétválhat, és így a kiegészített törtvég is megkeresheti a párját (SDSA: Synthesis dependent strand annealing). Ebben az egy esetben nem gond az eredeti viszonyok visszaállítása. Minden egyéb esetben viszont - mivel a Holliday junction tökéletesen szimmetrikus képződmény - a reszolváz enzim hasítása a két eredetileg különböző kromoszóma hibridjét hozhatja létre (crossing over). Ha a két kromoszóma valóban teljesen homológ, akkor ez nem probléma. Más esetekben viszont rekombinációhoz fog vezetni. Ilyen rekombinációs eseményeket használnak a meiózis során az eukarióta sejtek (szándékosan eltörve a kromoszómákat) hogy az apai és anyai eredetű génjeikből új kombinációkat hozzanak létre. Ugyanezt a jelenséget használják a homológ rekombinációra alapozott génmódosító módszerek is.

A homológ rekombináció vázlatos mechanizmusait a 14.2. ábra mutatja be.

14.2. ábra: A homológ rekombinációs javítás útjai és vázlatos mechanizmusaik

A sejtekbe juttatott linearizált rekombináns DNS-sel sokkal nagyobb hatékonyságú rekombinációt lehet elérni, mint a cirkuláris eredetivel. A végeket ugyanis - mivel nincs rajtuk a telomerekre jellemző védő szekvencia - az eukarióta sejtek törvégekként fogják érzékelni, és ez aktiválni fogja a kettőstörést javító mechanizmusokat. Kis szerencsével a sejt a végek visszabontása után meg fogja találni a hosszú homológ részek egyikét, és kereszteződést képez a saját kromoszómájával. Általában ez a kritikus lépés: ha az egyik véget sikerült megillesztenie, akkor a többi homológ szakaszt is nagyon könnyen megtalálja. Bár ilyenkor a "javítás" igazából lehetetlen feladat - hacsak a sejt nem kapcsolja össze a plazmidok végeit - a Holliday-junkció így is bizonyos valószínűséggel feloldásra kerül, így a sejt a saját, jó genomiális szakaszát adott eséllyel eldobhatja egy rossz templát kedvéért. Az eredmény egy genomjában célzottan módosított sejt lesz.