14.3. Gén-targeting konstrukciók előállítása

A legtöbb ma használatos célzott génmódosító eljárás a homológ rekombináción alapul. Ez azonban nem hasonlít az in vitro klónozáshoz. Sosem szabad elfelejteni, hogy itt egy spontán folyamatról van szó, amelynek hatásfoka még ideális esetben is meglehetősen alacsony. A leghatékonyabb ma használatos technikák is csak kb. 1% valószínűséggel eredményeznek "jó" célegyedeket, benne a célmolekulával. Ahhoz, hogy ezt ki tudjuk használni, nem elég a megfelelő DNS-darabot egyszerűen csak bejuttatni a célsejtbe. A valóságban a különböző pozitív és negatív szelekciós stratégiák ravasz kombinációjára van szükség. A gyakorlatban nagyon sokféle technikával lehet gén-targeting konstrukciókat előállítani. Itt csak néhány főbb módszert fogunk bemutatni, a teljesség igénye nélkül.

14.3.1. A recombineering alapjai. A Red rekombinációs rendszer

A homológ rekombinációt nemcsak eukarióta szervezetekben lehet használni: ilyen folyamatok prokariótákban is léteznek. Ezt a jelenséget fel lehet használni a plazmidok és mesterséges kromoszómák közötti DNS-darabok csereberéléséhez. A homológiát mutató DNS-darabok rekombináció révén például egyesíthetnek két különféle DNS-darabot, vektort (különösen ha csak egy homológ szakasz van). Ha a két DNS-darab több homológ szakasszal is bír, akkor a rekombináció átviheti a közöttük lévő darabot az egyikből a másikba ("bepattintás", angolul "pop in"). Ugyanígy, két homológ szakasz vektoron belüli párosodása a köztes darab kivágódásához, esetleg elvesztéséhez vezethet ("kipattintás", "pop out"). Pozitív (pop in esetén ) vagy negatív (pop out esetén) szelekciós markerek beépítése a kérdéses darabba felgyorsítja a folyamatot . Ezeket a módszereket szokták "recombineering"-nek (recombinogenic engineering) nevezni . Noha a baktériumok rekombinációs képessége önmagában viszonylag alacsony, az őket megfertőző vírusok némelyike jelentősen fokozza a homológ rekombináció esélyét: olyannyira, hogy akár a transzformációval bejuttatott rövid, lineáris DNS-darabok is rögtön beépülhetnek a megcélzott plazmidba. Ezt bizonyos törzsek módosításával nagy hatékonyságú in vivo klónozásra lehet használni.

A legelterjedtebb a Red rekombinációs rendszer. Ennek működéséhez a λ-fág három különböző génjére van szükség (Exo, Bet és Gam). Az Exo gén egy exonukleázt kódol, ami a bejuttatott kétszálú DNS-seket 5'→3' irányban visszanyesi, ragadós végeket hozva létre. A Bet fehérje a szabad, egyszálú DNS-végekhez kötődik, és megvédi őket a degradációtól. Végül, a Gam gén terméke blokkolja a baktérium saját RecBCD javító enzimét, amely egyébként szétszedné a bejuttatott lineáris DNS-t. A rekombináció létrejöttéhez a sejteknek aktívan növekednie kell, a beépülés ugyanis a DNS-szintézis közben, közvetlenül a replikációs villában történik. Mivel a virális gének aktiválódása akadályozza a baktérium normális életciklusát, ezért hőmérséklet-szenzitív rendszert használunk. Az E. coli tenyészetet 32oC-on tenyésztve a (defektív) profág formájában beépült λ-fág gének teljesen ki lesznek kapcsolva, de egy rövid hősokk révén (42oC) aktiválhatóak. Ezután a baktériumokat azonnal transzformálni kell. A Red rendszert fel lehet használni in vivo mutagenezisre is: ha egyszálú DNS-t juttatunk a baktériumba (például elektroporációval), akkor az be fog épülni a születő szál helyére. A módszer akkor a leghatékonyabb, ha az oligonukleotidunkat úgy tervezzük meg, hogy a szintézis során elmaradó szállal legyen homológ. A Red rekombinációs rendszer akár plazmiddal is bevihető a célsejtbe (a pSIM plazmidcsalád révén), ezért alkalmas arra, hogy bakteriális mesterséges kromoszómákból (BAC klónokból, illetve az azokat hordozó baktériumokból) genomiális darabokat klónozzunk át egy általunk meghatározott vektorba. Így akár egér vagy emberi kromoszómák sok ezer nukleotidos darabjai is könnyen átvihetőek a kívánt plazmidba. A Red rendszer bevitele után csupán egy feladatunk van: A megfelelő, a tervezett végekkel homológ kicsi szakaszokat kell beépítenünk a vektorunkba. De a célplazmidot a bejuttatás előtt linearizálni is kell, úgy, hogy a klónozni kívánt rész végeivel homológ rövid darabkák a vektor két szabad végére kerüljenek. Ezért a legkényelmesebb megoldás, ha a teljes vektor PCR termékét transzformáljuk, amit megfelelő (a célgénnel homológ) túlnyúló végekkel láttunk el, a PCR primerek ügyes megválasztásával. A rekombináció ezek után spontán ki fogja szedni a kívánt darabot a BAC klónból, és beépíti a vektorba, bezárva a plazmidot. Ugyanígy, a kívülről bevitt, PCR-rel létrehozott inszertek is egy lépcsőben (mindenféle restrikciós emésztés nélkül) "bepattinthatóak" a kívánt vektorba, ha a tervezett beépülési hellyel megfelelő homológia van minkét végen. Ezen előnyök miatt a Red rendszer a targeting vektorok építésénél ma az egyik leggyakrabban használt technika.

14.3.2. Gateway klónozás

A targeting vektorok építésénél gyakori probléma, hogy vektor-alapvázat kell cserélni a klónozás során. Ha itt is el szeretnénk kerülni a restrikciós emésztéseket, erre a leggyorsabb és leghatékonyabb technika az ún. "Gateway" klónozás. Ezt az Invitrogen cég által kifejlesztett módszert, mint hasításmentes klónozást röviden már említettük a 4.2.6. fejezetben. Itt is a l-bakteriofág életciklusát használjuk ki: mikor lizogén fázisba lép, a fág integrációját a gazdakromoszómába egy specifikus enzim (integráz, Int) irányítja, amely a fág cirkuláris DNS-sét egy adott helyen (AttP) felnyitja és egyesíti a bakteriális genom egy specifikus helyével (AttB). Az AttP és AttB helyek összekapcsolódásával hibrid szekvenciák keletkeznek: AttL ("bal vég") és AttR ("jobb vég"). A reakció maga egyirányú, de megfordítható: méghozzá a fág excíziós enzime (Xis) által. Ez az enzim a profág két végén található AttL és AttR szekvenciákat ismeri fel, szétvágja a DNS-t és keresztben újraegyesíti. Ezzel kivágja a fág-genomot és cirkularizálja azt, helyreállítva az eredeti AttB és AttP helyeket (ld. 14.3. ábra).

14.3. ábra: A λ-fág természetes lizogén életciklusa (A) és a Gateway klónozás sémája

A reakció mechanizmusa hasonlít a restrikciós klónozásra: a hasításkor itt is "ragadós" végek keletkeznek, amelyek a bázis-komplementaritás segítségével fognak újra egyesülni. Az AttB helyek általában rövidek, a beépülés során az AttP hely hosszú, nem szimmetrikus 5'- és 3'-végei megoszlanak az AttL és AttR között. Fontos észrevennünk, hogy egyik felismerő hely sem teljesen azonos a másikkal, mivel nem palindrom szekvenciákról, és csak részben komplementer párokról van szó. Viszont az enzimek érzékenyek a felismerő helyek homológia viszonyaira: ha az összetartozó pár egyikében például az AttP-ben) a homológ szakaszt kicseréljük, akkor a reakció csak akkor fog működni, ha ugyanezt a cserét az AttB-ben is végrehajtjuk. Az egész technológia ezen az észrevételen alapszik: a megfelelő, kompatibilis párokat számozással szokták jelölni. Ha tehát a plazmidunk tartalmaz két darab, megfelelően orientált AttL helyet (AttL1 és AttL2), amelyek egy "picikét" különböznek egymástól (a komplementer szakaszuk más), de pontosan megfelelnek egy másik vektor AttR helyeinek (AttR1 és AttR2), akkor az összetartozó helyek páronkénti egyesítésével a köztes darabok átkerülnek az egyik vektorból a másikba. A reakció in vitro kivitelezhető: ehhez csak a megfelelő LRenzimkeverékre van csak szükség (a valóságban nemcsak a Xis enzim kell, hanem az E. coli saját IHS -Integration Host Factor-fehérjéjére, sőt az Int integrázra is). A végtermék vektorokban az inszert két végén AttP1, és AttP2, illetve AttB1 és AttB2 helyek keletkeznek. Természetesen, ha a másik fajta, BPenzim keveréket használunk a végterméken (ami csak az IHF és az Int fehérjéket tartalmazza, Xis nélkül), akkor a reakció iránya megfordul, és visszakapjuk az eredeti konstrukcióinkat. (ld. 14.3. ábra) Nem szabad elfelejteni, hogy az AttL, AttR, AttB és AttP végek mind-mind érzékenyek az irányításra: ha az egyik véget véletlenül fordítva építjük be, akkor a két vektor fog egyesülni egymással, ahelyett hogy az inszertet vinnénk át - ezért nagyon figyeljünk oda a tervezésnél!

A Gateway klónozás különösen akkor előnyös, ha az inszertünket később nagyszámú, különféle vektorba szeretnénk átvinni. Ilyenkor az inszertet előbb egy alapvektorba (entry vector) építjük be, amely tartalmazza a megfelelő AttL1 és AttL2 végeket. A bevitel történhet magával a BP reakcióval is (ligálás-független klónozás, ld. 4.2.5. fejezet): ilyenkor a PCR-termék túlnyúló végei tartalmazzák az AttB1 és AttB2 helyeket, a plazmid pedig az AttP1 és AttP2 célszekvenciákat. Az inszertet utána nagyszámú különböző, AttR1 és AttR2-tartalmú célvektorba lehet átvinni - például a fehérjetermelés optimalizálása céljából. Az AttP, AttL, AttR helyeket tartalmazó "gyári" vektorokat úgy alkották meg, hogy a két rekombinációs hely között egy speciális negatív szelekciós marker legyen: a ccdB gén (F-plazmid eredetű DNS-giráz inhibitor) - ha a helyén marad - akadályozni fogja az átlagos E. coli sejtek növekedését, így a csak a kicserélődött inszertet tartalmazó klónokat fogjuk visszakapni. A különféle AttR és AttL párok összetettebb szublónozást is lehetővé tesznek: trükkös felhasználásukkal akár kis inszertek sorozatából is építhetünk egy nagy inszertet. A Gateway klónozás a targeting vektorok esetében a negatív rezisztencia-gének beépítésénél különösen hasznos: ezeket a végső célvektor tartalmazza, és ide lehet az összes különböző célzó (targeting) konstrukció magját berakni, mindenféle restrikciós emésztés nélkül, LR klónozással.

14.3.3. Targeting vektorok tervezése

Az összes szükséges főbb módszer ismeretében most már abban a helyzetben vagyunk, hogy akár meg is tervezhetjük a saját targeting vektorunkat. Elsőként a következő feltételt érdemes szem előtt tartani: az eukarióta rendszerek homológ rekombinációs módosításához nagyon hosszú homológ szakaszok kellenek. Akár génkiütést tervezünk, akár gént akarunk célzottan bevinni egy organizmusba, a konstrukciónk két homológ végének külön-külön legalább 1,5-2 kbp méretűnek kell lennie. Bár a két vég nem kell hogy egyforma hosszú legyen, jó ha együttes hosszuk legalább ~6 kbp. Egy másik fontos feladat a szelekciós markerek megválasztása. A tervezett konstrukció belsejébe (a homológ "karok" közé) legalább egy olyan rezisztencia-gén beépítése szükséges, amely a célszervezetben is aktív: ez lesz a pozitív szelekciós markerünk.

Eukarióta sejtek szelekciójára természetesen nem használhatunk olyan vegyületeket, amelyek csak a baktériumokra hatnak (pl. ampicillin): neomicin, blaszticidin, puromicin vagy zeocin antibiotikumokat szoktunk alkalmazni. Ezek többsége mind prokariótákban, mind eukariótákban hatékony: tehát lehetővé teszi, hogy olyan rezisztencia-génekkel szelektáljunk, amelyeket úgy terveztünk meg (dupla promóterrel, Shine-Dalgarno és Kozak szekvenciákkal), hogy mind a klónozásra használt E. coli-ban, mind pl. egér sejtekben expresszálódjanak. A pozitív szelekciós marker azonban önmagában nem elegendő. A vektorból eredő, a homológ karokon túlnyúló végekre kell legalább egy negatív szelekciós marker, hogy a nagyon gyakori nem-homológ rekombinációs eseményeket (NHEJ) megpróbáljuk kiszűrni. A homológ rekombináció a rezisztenciát hordozó kazetta (kazetták) két végén lévő hosszú homológ karokon fog bekövetkezni, így a negatív szelekciós marker (“érzékenységi gén”) ilyenkor (és csak ilyenkor) kiesik (ld. 14.4. ábra).

Gén targeting vektorok vázlatos felépítése és a kromoszómába való beépülés lehetséges módjai

14.4. ábra: Gén targeting vektorok vázlatos felépítése és a kromoszómába való beépülés lehetséges módjai: homológ rekombináció (A) és random beépülés (B)

A gyakrabban használt érzékenységi gének közé tartozik a diftéria toxin A-alegység (növényekben is használható), vagy a citozin-dezamináz enzim. Emlős rendszerekben leginkább a herpeszvírustimidilát-kináz (TK) gént használják, ez ganciklovir jelenlétében a sejtek pusztulásához vezet. Mivel az egyoldali homológ beépülés nagyon ritka folyamat, ezért a legtöbbször elegendő, ha csak az egyik nem homológ karon található egy negatív szelekciós marker.

Végül, de nem utolsósorban a génmódosítást ellenőrző tesztekről (assay) kell gondoskodnunk. Ezekkel tudjuk ugyanis bebizonyítani, hogy a targeting vektorunk megfelelően célba talált-e. A legtöbb vektor-építési lépés ellenőrzésére a PCR is megfelel, a célszervezetben azonban praktikusabb Southern-blot eljárást használni. Egy jó stratégia lehet például a következő: a próbáinkat tervezzük úgy a célszervezet kromoszómájára, hogy éppen kívül essenek a targeting vektorban használt hosszú karokon. Válasszunk olyan restrikciós enzimet, ami belehasít az általunk bevitt kazettába, de az eredeti genomiális szakaszba nem. Az emésztett kromoszomális DNS-hez így a helyes és rossz beépülés esetén máshol fog hibridizálni a próbánk. Mivel a vektor építése is meglehetősen bonyolult, ezért mindenképpen ellenőrizzük a konstrukciónkat a célszervezetbe juttatás előtt! Csak teljesen szekvenált vektorral ajánlatos dolgozni, és a homológ karok, valamint a beépített kazetták hosszát és orientációját is mindig ellenőrizni kell, megfelelően tervezett Southern-blot próbák, restrikciós térképezés és/vagy PCR segítségével.

14.3.4. A gén-targeting konstrukciók elkészítése

Egy targeting vektor építése nem egyszerű feladat. Ehhez szükségünk van a célszervezet genomiális DNS-sének megfelelő szakaszára. Egy megfelelő, genomiális DNS-t tartalmazó mesterséges baktérium-kromoszóma (BAC klón) megvásárlása ilyenkor nagy segítség lehet. Ha a hagyományos, PCR-alapú eljárást választjuk, akkor keresnünk kell olyan restrikciós helyeket, amelyek nincsenek jelen a megcélzott genomiális szakaszon. Ezután három külön PCR-rel felszaporítjuk a két homológ karnak megfelelő szakaszt, továbbá a közéjük beépítendő (szelekciós és módosító) kazettát. A restrikciós emésztések után (amely helyeket a primerekkel vittük be) egy hármas ligálást kell végrehajtanunk (három inszert egy plazmidba)! Természetesen haladhatunk lépésenként is, de akkor nincs mód sehol a szelekcióra, szűrni kell a klónokat; ezért ez az eljárás meglehetősen fáradságos és lassú. Ha azonban sikerült a ligálás, akkor a plazmid elkészült, mivel tartalmazza a negatív szelekciós markert és a linearizációhoz szükséges extra hasítóhelyet. A hagyományos módszer gyengesége a restrikciós hasítóhelyekben rejlik: nem minden esetben van mód ugyanis ezek alkalmas megválasztására. Továbbá a nem-kódoló genomiális szekvenciában polimorfizmusok lehetnek, amelyek előre nem látható módon hasítóhelyeket hozhatnak létre. Szintén fontos hogy a PCR után minden klónt elejétől-végéig ellenőrizni kell (szekvenálással), hogy ne vigyünk be a rekombinációval nem kívánt mutációkat.

A modernebb, recombineering-alapú eljárások ezen hátrányokat jórészt kiküszöbölik. Ilyenkor a Red rekombinációt használjuk a konstrukció megépítéséhez. A BAC-klónt tartalmazó baktériumokat a pSIM plazmiddal transzformálva bevisszük a Red rendszert. A módosító kazetták beépítése és a kiszemelt vektorba való átemelés egyaránt in vivo történik, a hősokkolt baktériumok PCR termékekkel való elektroporálása után. A kazetták beépítését egyszerűen antibiotikum-szelekcióval ellenőrizhetjük. Ezután a vektoron is PCR-t hajtunk végre - a tervezett homológ karok két szélével röviden azonos, kb. 40-50 bázispáros túlnyúló véggel - és ezzel transzformálunk. Így tudjuk kiemelni a BAC klónból a kívánt szakaszt. Ennél az egy lépésnél nem tudunk szelektálni: ezért plazmidot kell preparálnunk és ellenőrzés után újra transzformálnunk. Ezt a lépést ki lehet váltani köztes vektor használatával (amely pl. lehetővé teszi a kék-fehér szelekciót az átemeléskor). Ebben az esetben megcserélhetjük a klónozási sorrendet, és a kiemeléssel kezdhetünk. Ha az összes kívánt elemünk a helyére került, akkor következhet a vektor-alapváz cseréje, így a rendszerbe belekerül a negatív szelekciós marker, és egy vagy több megfelelő, ritka restrikciós hasítóhely is. Ha az első lépésben olyan vektort használtunk, amely Gateway-kompatibilis, pl. AttL végeket tartalmaz a klónozó hely két végén, akkor ezt a végső lépést nagyon egyszerű lesz végrehajtani: az inszertünk a végleges vektor AttR végeivel fog rekombinálódni egy in vitro LS klónozási reakció után. A célszervezetbe való bejuttatás előtt azonban restrikciós emésztéssel linearizálni kell a vektort.