14.4. A targeting-konstrukció bejuttatása a célszervezetbe

14.4.1. Sejtek és sejtvonalak transzfektálása. Emlős embriók manipulációja

Ha a génmódosítást állati sejttenyészeten kívánjuk végrehajtani, akkor a DNS bejuttatása viszonylag egyszerű feladat. Akár embrionális őssejteket (ESC: embryonic stem cell), akár daganatos sejtvonalakat kívánunk megcélozni, a protokoll minden esetben nagyon hasonló. Ugyanúgy kell eljárnunk, mint a plazmid-alapú fehérje expressziókor (ld. 4.3.2. fejezet). A sejteket lehetőségünk van elektroporálni is, de ennél gyakrabban használjuk a kémiai ágenseken alapuló transzfekciós módszereket. Ilyenkor vagy kationos lipideket vagy kationos, elágazó szerves polimereket (dendrimereket) keverünk a linearizált plazmidhoz, és a sejtekhez. Ezek komplexet képeznek a DNS-sel, de egyúttal destabilizálják a sejtmembránt is, így a plazmid-reagens komplex be tud jutni a membránon keletkező lyukakon.

A transzfekció után antibiotikum (pl. a neomicin-analóg G418) használatával szelektálnunk kell a transzfektált sejteket. A be nem épült plazmidok nem szaporodnak, így az osztódások során előbb-utóbb "kihígulnak" a tenyészetből: csak a kromoszómába beépült rezisztencia-gén fog stabilan (hetek-hónapok múlva is) megmaradni. Mivel a véletlen integráció (NHEJ) lesz a beépülés leggyakoribb módja, a pozitív mellett negatív szelekcióra is szükségünk lesz: ezt állati sejteken leginkább a médiumhoz adott ganciklovirrel szokták végezni (a vektorok timidilát-kináz gént tartalmaznak). Csak az a sejtpopuláció esélyes arra, hogy hordozza a transzgenikus kazettát a genom megfelelő helyén, amely túlélte a dupla szelekciót. Ha knock-out vagy knock-in egeret szeretnénk létrehozni, a következő lépésben az embrionális őssejteket 3,5 napos blasztociszta stádiumú embriókba kell injektálnunk (mikroinjektorral). Az embriókat általában in vitro fertilizációs eljárással állítjuk elő, de hogy a folyamat sikeres legyen, a beültetésről is gondoskodnunk kell. Steril hímmel való pároztatással a befogadó nőstény egér méhét a megfelelő fázisba hozzuk (álterhesség).

Célzott génmódosítás és célzás nélküli génmódosítás létrehozása egérben

14.5. ábra: Célzott génmódosítás (A) és célzás nélküli génmódosítás létrehozása egérben (B). Az utóbbi eljárással transzgenikus egeret hoztunk létre.

A kezelt embriókat a befogadó, álterhes egér uterusába fecskendezve valódi terhességet hozunk létre. A születő kisegerek genetikailag kimérák lesznek, amelyek szerencsés esetben a csíravonalukban is hordozzák az eredeti, módosított sejtek utódait. Az egerek pároztatásával, majd (szükség esetén) beltenyésztésével hozhatóak létre a tisztán transzgenikus állatok (az állatokat természetesen genotipizálni kell, pl. Southern-blottal vagy PCR-rel). Az eljárás sémáját a 14.5. ábra foglalja össze.

14.4.2. Stabil transzfekció. Transzgének célzás nélküli bevitele

Amennyiben a transzgént célzás nélkül szeretnénk beépíteni a célszervezet genomjába, a fentieknél jóval egyszerűbb dolgunk lesz. Ilyenkor nincs szüksége sem homológ végekre, sem negatív szelekcióra: egyszerűen a cél-kazettával (ill. az azt hordozó plazmiddal) transzfektálunk, amely tartalmazza a bevinni kívánt gént és egy megfelelő rezisztencia-gént. Az antibiotikum-szelekció ki fogja szűrni azokat a klónokat, ahol (főleg NHEJ révén) a genomiális DNS-be beépült a kazettánk. Sejtvonalak esetén ezt hívják stabil transzfekciónak: ennek főleg a gyógyszeripari biotechnológiában van nagy jelentősége (ld. a következő fejezetet). A leggyakrabban használt CHO (Chinese hamster ovary) sejtekből például hiányzik a dihidrofolát-reduktáz gén. Ha ezt a vektorunkkal bevisszük, akkor metotrexát jelenlétében csak azok a sejtek lesznek képesek tartósan növekedni, amelyek genomjába integrálódott a konstrukciónk. Így elkerülhető a drága antibiotikumok használata is. Mivel a nem-homológ rekombináció emlősökben nagy hatékonyságú folyamat, ez könnyűvé teszi a célzás nélküli transzgén egerek létrehozását. Ilyenkor nincs is szükség az előzetes szelekcióra: A vektor DNS-t közvetlenül az in vitromegtermékenyített petesejtbe juttatjuk be (mikroinjektorral). A beültetés itt is a megfelelő álterhes egérbe történik, s a megszületett kisegereket alkalmas markerekkel genotipizálva lehet megtalálni a sikeres transzformánsokat.

14.4.3. Növényi és gomba sejtek transzformálása. Homológ rekombináció növényekben

Az állati sejtekkel ellentétben, amelyek gyakran "csupaszak", a többi eukarióta élőlény membránját kívülről vastag sejtfal burkolja. Ez a DNS bejuttatása szempontjából is komoly akadályt jelent. Így növények és gombák genetikai módosításához a DNS-t nem lehet önmagában csak az eddig említett kémiai módszerekkel bevinni. A sejteket természetesen elektroporálhatjuk, sőt, a (később említésre kerülő) génpuskát is bevethetjük rajtuk, de van ennél egyszerűbb megoldás is: el kell távolítani a sejtfalat. Gombáknál ezt hívjuk szferoplaszt módszernek. Ilyenkor enzimatikus emésztéssel, kitinázzal szabadulunk meg részben a sejtfaltól; a keletkező sejteket nagy ozmolaritású cukoroldatban (1 M szorbitol) kell reszuszpendálni, és nagyon óvatosan szabad csak kezelni (spontán kilyukadhat a membránjuk). Élesztőgomba sejtek (pl. Saccharomyces cerevisiae, Pischia pastoris) sikerrel transzformálhatóak a sejtfal leemésztése nélkül is, méghozzá lítium-acetát, nagy molekulatömegű polietilén-glikol (PEG 4000) és hősokk együttes alkalmazásával (lítium-módszer). Növényektranszformálásakor szintén előbb a sejtfalat távolítjuk el: celluláz és pektináz együttes alkalmazásával. A (például levelek szétdarabolása után) keletkező, emésztett sejteket itt is megfelelő ozmolaritású oldatban (pl. 0,6 M mannitol vagy 0,25 M CaCl2) kell tartani. A gombákhoz hasonlóan, a lecsupaszított növényi sejtek (pl. Arabidopsis protoplasztok) könnyen transzformálhatók csupán a plazmid DNS és polietilén-glikol hozzáadásával (pl. 25% PEG 6000) is. A növényi sejtek azután megfelelő körülmények mellett visszaépítik a sejtfalat, osztódásnak indulnak (protoplaszt regeneráció), majd teljes növényi embrióvá alakulhatnak át (szomatikus embriogenezis). A regeneráció közben a sejteket a bevitt kazetta rezisztencia-génjével szelektálni lehet, de egyéb szűrés is megvalósítható (pl. GFP gén bevitelével). Maga a protoplaszt regeneráció alacsony hatékonyságú folyamat (nagyjából 10000, vagy több sejtből lesz egy teljes növény). A homológ rekombinációs megközelítés sikerrel használható pl. mohák (Physcomitrella patens) genetikai módosítására, de a magvas növényekben ezek a módszerek sajnos csak alacsony rekombinációs hatékonyságot tesznek lehetővé: ma is van igény a célzást elősegítő új módszerekre.

14.4.4. Növények genetikai módosítása Ti plazmid segítségével

Növényi sejtek genetikai módosítására a protoplaszt-regenerációnál hatékonyabb módszerek is léteznek. A legrégebben ismert, és ma is a leggyakrabban használt eljárás egy különleges növényi parazita, az Agrobacterium tumefaciens tumor indukáló (Ti) plazmidját használja. Ez a baktérium többféle kétszikű növény gyökerén élősködve, az E. coli-ból ismert F-plazmidhoz hasonló konjugációs rendszert használ a gazda megbetegítésére. Ebben az esetben a konjugáció nem két baktérium között következik be, hanem az Agrobacterium a gazdanövény sejtjébe viszi át a plazmid egy részét, ahol az a genomba integrálódik. A Ti plazmid nagyméretű (~200 kbp), és számos operont tartalmaz. A daganatképzésért illetve a baktériumot ellátó tápanyagok szintéziséért felelős (eukarióta rendszerű) géneket a mesterséges konstrukciókban általában eltávolítjuk (disarming), ezek helyére lehet beépíteni a bevinni kívánt géneket. Az átvitelhez illetve a beépüléshez csupán a plazmid két speciális szekvenciájára ("bal szél", LB és "jobb szél", RB ) valamint a virulenciát biztosító Vir operonra van szükség. A Vir operon valójában legalább 18 különböző gént tartalmaz: a plazmid átvitele ezek kooperációjával valósul meg. A VirA gén egy receptor-hisztidin-kinázt kódol, ami érzékeli a növény sérülésekor felszabaduló anyagot (acetosziringon). A VirG fehérje foszforilációja révén aktiválódik és bekapcsolja az operon többi génjét. A VirC1 (felismerő) és VirD1/2 (endonukleáz) fehérjék a plazmid megfelelő végeihez (LB és RB) kötődve annak hasítását eredményezik. A letekeredő, egyszálú DNS-t a VirD2 és VirE2 fehérjék védik meg a degradációtól, egyben a VirB gén terméke által létrehozott pórushoz is irányítják, amelyen keresztül az a növényi sejtbe exportálódik. A VirD2 és VirE2 fehérjék továbbra is kapcsolódnak a DNS-hez: ezek a növény sejtmagjába irányítják a DNS-darabot, és lehetővé teszik az integrációját (a VirD2 a gazda DNS-javításába is beleszól). Ez jórészt véletlen rekombináció révén megy végbe. A bal szél és jobb szél közé (az úgynevezett T-DNS régióba) beépített gének így a gazdanövény kromoszomális DNS-ébe integrálódnak (ld. 14.6. ábra).

Ti plazmid térképe

14.6. ábra: Ti plazmid térképe. A T-DNS régió helyettesíthető az inszerttel.

Az átviteli mechanizmus azonos a nopalin és oktopin típusú Ti plazmidoknál, amelyek egyébként sokban különböznek egymástól, de mindkettőt lehet génbevitelre használni. Bár a Ti plazmid túl nagy a közvetlen klónozáshoz, az e célra tenyésztett Agrobacterium törzsek plazmidjait manipulálhatjuk többféle módon is: bakteriális homológ rekombinációval (pop-in) be lehet vinni a kívánt géneket a "lefegyverzett" (disarmed) Ti plazmid T-DNS régiójába egy kisebb köztes vektorból is, amit E. coli-ban szaporítunk. De e helyett ma már inkább dupla vektorrendszert (binary vector) használunk: ilyenkor az Agrobacterium törzs az eredeti Ti plazmid egy kis darabját tartalmazza, amely szinte csak a Vir operonból áll (helper plazmid). Az RB és LB végeket csak a másik plazmidba építjük be, ami a célgént is tartalmazza, és E. coli-ból preparálható (ld. 14.7. ábra) Ezt a plazmidot Agrobacterium-ba transzformálva, a baktériumokat antibiotikummal szelektálva, majd a növényi sejttenyészeteket fertőzve nagy hatékonyságú génbevitel érhető el. A megtámadott sejteket tartalmazó kalluszokból pedig transzformált embriók nyerhetőek.

14.7. ábra: Az Agrobacterium kettős vektorrendszere

A fejlődő virágok fertőzésével a csírasejtek direkt módosítása is megvalósítható ("virágbemártás", floral dip módszer). A legutóbbi időkben sikerült olyan Agrobacterium törzseket létrehozni, amelyek egyszikű növényeket (pl. gabonákat) is képesek fertőzni. Bár a rendszer önmagában célzás nélkül működik, ez nem jelenti azt, hogy nem lehet homológ rekombinációra is használni. Megfelelő pozitív-negatív szelekciós konstrukciókkal elfogadható hatékonyágú (>0,1%) homológ rekombináció és célzott génmódosítás érhető el. Mindezt azonban a jelenlegi növényi géntechnológia alig-alig használja ki: a mezőgazdasági biotechnológia legtöbb mai céljára a célzás nélküli génbevitel is általában megfelel.