14.5. Knock-out és knock-in technikák

A célzott génmódosító eljárások egyik első célja (és ma is az egyik fő felhasználása) a génjeikben elrontott, null mutáns(KO: knock-out) élőlények előállítása volt. Ezen mutánsok tanulmányozása sokat segíti a molekuláris biológiai folyamatok megértését. Továbbá a genetikailag módosított emlősállatok számos genetikai eredetű emberi betegség modelljéül szolgálhatnak.

14.5.1. Homing endonukleázok. Cre/Lox és Flp/Frt rendszerek

A modern génkiütési technikák speciális endonukleázok használatán alapulnak. Jóllehet egyszerű funkcióvesztéses mutánst létre lehet hozni csupán homológ rekombinációval is, a rezisztencia-gén jelenléte az eukarióta genomban nem kívánatos jelenségeket eredményezhet (a kromatin módosítása miatt befolyásolja a környező gének expresszióját). Így mindenképp szükség van olyan enzimekre, amelyek in vivo is képesek - a bakteriális restrikciós enzimeknél jóval nagyobb célzási pontossággal - specifikus módon szabni-varrni a célszervezet genomiális DNS-sét. Az ilyen tulajdonságokkal rendelkező, természetben is megtalálható enzimeket hívjuk homing endonukleázoknak. Ellentétben a bakteriális restrikciós enzimekkel, ezek hosszú (14-44 nukleotidos) DNS-szakaszokat ismernek fel, és nagyon specifikus folyamatokban játszanak szerepet. Jó néhányuk "önző" genetikai elemek: vírusok és transzpozonok részét képzi. Ilyen például a Chlamydomonas zöldalga I-CreI enzime (nem keverendő össze a Cre-rekombinázzal): ez abból az intronikus szekvenciából íródik át, amely a saját aktivitása következtében tud integrálódni a genomba (transzpozon-szerűen). A homing endonukleázoknak számos családja létezik, a mindennapi gyakorlatban két ilyen fehérjét használunk a célzott génmódosításokhoz: a Cre-rekombinázt (ld. 14.8. ábra) és az Flp ("flippáz") enzimet.

14.8. ábra: A Cre-rekombináz katalitikus ciklusa

A Cre-rekombináz eredetileg a P1 bakteriofágból ered, szerkezetileg hasonló a λ-fág integráz enziméhez. A felismerő helyének külön neve van: LoxP (locus of crossover-P1). Ez a két szélén palindrom, középen viszont aszimmetrikus nukleotid szekvenciát jelent (ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT), ezért a LoxP helyek nem szimmetrikusak, irányultságuk van. A hasítás a nem palindrom szakaszon belül fog bekövetkezni. A Cre-enzim azonban nem csak endonukleáz aktivitással rendelkezik, hanem (a tetramerizáció révén, saját DNS-ligáz aktivitása révén) elősegíti a szabaddá vált végek egyesülését is (site-specific recombination). Ez által a két (megfelelően irányított) LoxP hely közötti DNS-darab a Cre-enzim hatására kivágódik és cirkularizálódik. A kivágott darab az osztódások során általában elvész, deléciót hozva lére. A reakció "keresztben" is végbemehet: két kromoszóma karjait például fel lehet cserélni, ha mindkettő tartalmaz egy-egy LoxP helyet (transzlokáció). Az egy kromoszómán belüli két fordított LoxP hely rekombinálása pedig inverzióhoz vezethet. Ily módon a Cre gént hordozó plazmid átmeneti bevitele egy sejtbe vagy sejtvonalba (tranziens transzfekció) permanens genetikai változásokat tud okozni a szervezet genomjában, ráadásul célzottan, a LoxP helyek pozíciójától függően. Ezen helyek ügyes beépítésével tehát képesek vagyunk késleltetett in vivo rekombinációs folyamatokat vezérelni.

Egyszerű kísérletekhez egy rekombinációs rendszer is elegendő, de az összetettebbekhez (mint a feltételes génkiütés) több, független enzimrendszerre van szükség. A másik gyakran használt rendszer az Flp ("flippáz") enzimen alapszik. Ez a sörélesztőből izolált enzim felelős a Saccharomyces törzsek plazmid szerű törpe DNS-gyűrűinek („2-mikron” plazmid, ld.13.1.6. fejezet) fenntartásáért. A felismerő helyeinek neve Frt (Flp recognition target), ez a LoxP helyekhez hasonlóan középen nem szimmetrikus, a két szélén viszont majdnem vagy teljesen palindrom (GAAGTTCCTATTC-TCTAGAAA-GTATAGGAACTTC). Az Flp-enzim is dimerizálódik a cél DNS-en, és középen, a nem szimmetrikus szekvenciánál hasít. A Cre-rekombinázhoz hasonlóan, a középső szakaszra igazából csak a rekombinációhoz van szükség, az endonukleáz aktivitáshoz nem kell. Így ezen szekvencia megváltoztatásával lehetőség van egy-egy rendszerből önmagában is több, keresztben nem kompatibilis felismerő helyet létrehozni (hasonlóan a Gateway vektorok AttR és AttL helyeihez). Ezeket a mesterségesen létrehozott, tervezett rekombinációs helyeket az eredeti neve mögé (mínusz egy betűvel) tett számozással szokták jelölni. Így például egy Fr3 hely csak egy másik Fr3 hellyel tud rekombinálódni (egy Fr5 hellyel nem), de ugyanúgy az Flp-enzim irányítja a folyamatot, mint az eredeti Frt helyen. Így egy enzim (átmeneti) expressziójával potenciálisan több, jól irányított rekombinációs eseményt is tudunk vezérelni. A módszer egyetlen korlátozása a felismerő helyekben rejlik: ezeket a helyeket előbb be kell építenünk a genomba (megfelelő targeting vektorral), hogy képesek legyünk a célzott génmódosításra. Ezért az utóbbi időben komoly erőfeszítés történt tervezetten átalakított homing endonukleázok létrehozására (pl. I-CreI mutánsok), amelyekkel a genomiális szekvenciák sokkal nagyobb tárháza célozható meg; akár természetes genomiális szakaszok is célba vehetőek. A homing endonukleázokkal kiváltható mutációk sémáját a 14.9. ábra foglalja össze.

14.9. ábra: Kromoszomális mutációk kiváltása homing endonukleázokkal

14.5.2. Célszekvenciára tervezett hasító enzimek. Cink-ujjas és TALE-nukleázok

A kromoszomális DNS célzott átszabása iránti nagy igény egészen újszerű módszerek kifejlesztéséhez vezetett. A 2010-es években jelentek meg először olyan technológiák, amelyekkel mód van lényegében tetszőleges genomiális régió hasítására illetve rekombinálására. Erre a homing endonukleázok általában nem alkalmasak, hiszen a fehérje szubsztrátfelismerő és katalitikus régiója egymástól nem választható el. E helyett olyan mesterséges enzimeket kellett tervezni, amelyek egy DNS-felismerő elem és egy laza specificitású endonukleáz katalitikus domén fúziójával hozhatóak létre (moduláris felépítés). Jelenleg két ilyen megközelítés létezik, amelyet a gyakorlatban is használnak: az egyik közülük az úgynevezett cinkujjas nukleázokon (ZFN: Zinc finger nucleases) alapszik (ld. 14.10. ábra). A természetes cinkujjas transzkripciós faktorok a DNS-hez jól meghatározott szekvencia-specificitással kötnek, méghozzá leggyakrabban három cinkujjal. A cinkujjak irányított mutációival ez a specificitás megváltoztatható, így a fehérjék nagyon sokféle célszekvenciához hozzáidomíthatóak. Hosszabb "cinkujj-fűzérekkel" még nagyobb specificitás hozható létre: akár a genom egyedi szakasza is célba vehető. Ilyenkor a megfelelő nukleázzal (pl. FokI) képzett fúziós fehérje célzottan el tudja vágni a kromoszomális DNS-t a felismerő hely közelében. A ZFN technológia tehát szükségtelenné teszi a módosító helyek beépítését: a vad típusú genomokban is működik. A mesterséges nukleázok átmeneti bevitele (pl. plazmiddal) önmagában is rekombinációkat okoz: tartósabb expresszió esetén a nagyszámú hasítás-javítás ciklussal járó hibákkal könnyű célzott pontmutációkat vagy deléciókat létrehozni. Több, különböző célszekvenciára tervezett nukleázzal pedig komplex átrendezéseket lehet végrehajtani a illető organizmus genomjában. A módszer kombinációja a targeting vektorokkal (miszerint célzott kettőstörést okozunk a kiszemelt génben, amihez a bejuttatott DNS tökéletesen passzol) nagyságrendekkel emeli a homológ rekombinációs módosítások hatékonyságát is.

14.10. ábra: A cink-ujjas nukleázok felépítése

A módszer hátulütője, hogy itt minden egyes genomiális szakaszra külön tervezett enzimre van szükség. Maguk a cinkujjas nukleázok is bizonyos szempontból korlátozottak, egyes DNS-szekvenciákon nem elég szelektív a működésük. Ez abból a tényből fakad, hogy a cink-ujjak a célszekvenciát blokkokban ismerik fel, nem pedig egyedi nukleotidonként. Léteznek viszont olyan természetes fehérjék, amelyek ezen a szinten is tökéletesen modulárisak. Az erre épített technológiát hívják TALE-nukleázoknak (TALEN: transcriptional activator-like effector nucleases; ld. 14.11. ábra). A fúziós fehérje alapja itt egy, a parazita Xanthomonas baktériumokból izolált fehérjecsalád. Ezeket a fehérjéket a baktérium termeli, és juttatja be a gazdanövénybe azért, hogy ott bizonyos géneket célzottan aktiváljanak. Innen kapták a nevüket (transzkripciós faktorokhoz hasonlítanak). A szerkezetük erősen repetitív: minden egyes rövid, 34 aminosavas szerkezeti blokk (repeat) egy-egy nukleotid kötéséért felelős, mégpedig nagy specificitással. Így az általunk megtervezett repeat-sorrenddel az egész TALE fehérje a kívánt DNS-szekvencia "tükörképe" szerint építhető fel (általában párban, hogy mind a két DNS-szálat elhasítsuk). Mindezt nem-specifikus endonukleáz doménekhez (FokI) kapcsolva egy új fajta mesterséges endonukleáz lesz az eredmény. Az egyetlen nehézség a gén mesterséges előállításával (gén-szintézissel) van: ez ugyanis a repetitív DNS-szekvenciák miatt nem a legegyszerűbb feladat, de általában megoldható.

14.11. ábra: TALE-nukleázok és felismerőhelyük

14.5.3. Génkiütési technikák (knock-out) és új gének célzott beépítése (knock-in)

Ahogy azt láttuk, a génkiütési (knock-out) technikák ma már általában túlmutatnak a genomiális szekvenciák egyszerű elrontásán. A gén tönkretétele céljából elegendő csupán egyetlenexont - amely az összes izoformában jelen van - valami egyébbel, pl. a rezisztencia-gén kazettájával kicserélni. A módszer akkor biztos, ha frameshift-et (leolvasási keret eltolódást) is okozunk az exon kiesésével. Ez az eljárás hatékony, de sokszor önmagában még nem elegendő.

A géncsapdázás vázlata

14.12. ábra: A géncsapdázás vázlata. Kombinált knock-out és knock-in módszerek

Felmerülhet az az igény, hogy a célszervezetben csak a kívánt módosítást hajtsuk végre: ne hagyjunk magunk után sok "DNS-szemetet", például a rezisztencia-géneket. Erre a célra (amelyet néha a "delitto perfetto" - olaszul a "tökéletes bűntény" - elvének is neveznek) a rezisztencia-gének köré általában egy Frt vagy LoxP párt építünk be. A megfelelő stádiumban (pl. az embrionális sejtek szelekciójának megtörténte után) a Cre vagy Flp gént hordozó plazmid átmeneti bevitelével a szelekciós gént vagy géneket eltávolítjuk, így azok nem szólnak bele sem a splicing folyamatába, sem az organizmus fenotípusának kialakításába. Ugyanez érhető el, ha a megfelelő mutáns egerünket egy olyan törzsbéli egérrel keresztezzük, amely már a korai embrionális fejlődés során is expresszálja a Cre- vagy Flp-enzimet (deleter strain).

Természetesen vannak olyan helyzetek is, amikor kifejezetten szeretnénk beavatkozni az eredeti gén működésébe: például ha új genetikai elemeket viszünk be a kromoszomális DNS-be (knock-in). Ez kombinálható a génkiütéssel is: ha a targeting vektorunk nemcsak a rezisztencia gént tartalmazza, hanem előtte egy másik, riporter-gént is, akkor az megfelelő beépülés esetén átírhatóvá válik. Ilyet eredményez, ha a riporter-gént úgy alakítjuk ki, hogy képes legyen splicing révén fúziós fehérjét alkotni az eredeti fehérje elejével – ez a “géncsapda” (gene trapping) (ld. 14.12. ábra). Ugyanígy, a riporter (pl. GFP, béta-galaktozidáz) beépíthető az első exon helyére is (promóter trapping), sőt, ha van saját promótere, akár az eredeti promóter helyére is (enhancer trapping). Ezek a konstrukciók nemcsak a célzás sikerességéről adnak egyértelmű visszajelzést, de még az eredeti gén expressziós mintázatát is nyomon követhetjük velük. Ha a két bevitt (csapda és rezisztencia) gén méretét szeretnénk minimalizálni, a második gén átírása saját promóter nélkül is megoldható, IRES elemekkel (bicisztronos eukarióta konstrukció).

Amikor az egértörzsünk genomjában egy adott helyen már van egy alkalmas rekombinációs helyeket (pl. egy Frt/Fr3 párt) tartalmazó kazetta, ezt célzott génbevitelre (knock-in) is felhasználhatjuk. Ilyenkor a meglévő kazettát egy tranziensen bevitt plazmid új kazettájára lehet kicserélni (feltéve hogy ugyanazokat a rekombinációs helyeket tartalmazza, azonos orientációban, mint a kromoszóma). A Cre vagy Flt rekombinált embrionális őssejtekből pedig a szokásos módon lehet kimérákat majd genetikailag tiszta egereket létrehozni (Recombinase-mediated cassette exchange).

14.5.4. Feltételes génkiütés, génjavítás

A homing endonukleázok vezérlése lehetővé teszi a rekombinációs események idő- és térbeli szabályozását is. Ezt ki lehet használni akkor, amikor csak a fejlődés adott pontján szeretnénk elrontani a megcélzott gént, vagy esetleg szövetspecifikus genetikai módosítást akarunk végrehajtani. Erre szolgálnak a feltételes génkiütési ("conditional knock-out") technikák. Ilyenkor olyan organizmusokat (pl. egértörzseket) használunk, amelyek genomjába a Cre- vagy Flp-rekombinázt előzőleg indukálható promóterrel építettük be. A gyakorlatban az egyik legnépszerűbb a tetraciklin-indukálható rendszer - ilyenkor a Cre gén promóterét egy Tet-represszor kötése tartja kikapcsolva (aminek génjét szintén beépítettük a rekombináz mellett). A rekombináció a tet rendszerben az egerek doxiciklinnel történő etetése után valósul csak meg. Természetesen a feltételes génkiütés esetén úgy kell megterveznünk a targeting vektort, hogy a gén a rekombináció nélkül még tökéletesen működjön. Ezért ilyenkor legalább két kazettát kell beépítenünk (két külön antibiotikum-rezisztenciával), méghozzá a megcélzott exon(ok) két oldalára. A kazettáknak szigorúan az intronikus régióba kell kerülniük, úgy, hogy a splicing folyamatát ne zavarják (150-200 nukleotidra az exon-intron határoktól). A rezisztencia-gének két oldalára egy-egy kompatibilis felismerő hely-pár kerül: az egyiket pl. Frt helyekkel, a másikat Fr3 helyekkel vesszük körül. Melléjük pedig egy-egy LoxP helyet teszünk. A hármas (kétszeresen pozitív, egyszeresen negatív) szelekció megtörténte után a két kazettát a tranziensen bevitt Flp-rekombinázzal eltávolítjuk: csak a LoxP helyek maradnak meg sértetlenül a genomban.

Az ilyen genotípusú egér általában megkülönböztethetetlen lesz az eredetitől: egész addig, amíg a Cre-Tet törzzsel nem keresztezzük, és az utódokat elkezdjük doxiciklinnel kezelni. Ekkor meg fog történni a rekombináció, és a kiszemelt gén működésképtelenné válik. Ez különösen akkor hasznos technika, ha tudjuk hogy az illető gén az embrionális fejlődésben más szerepet tölt be, mint felnőttben (korai kiütése esetleg letális). A Cre-Tet rendszer azonban csak egy a sok lehetséges változat közül: lehetőség van sejttípusspecifikus rekombináz promóterek előállítására is: ezek csak az adott, differenciált sejttípusban fogják végrehajtani a rekombinációt. Még arra is van mód, hogy a génkiütés ellentétét végrehajtsuk, és szabályozott módon megjavítsuk a kérdéses gént. Ez úgy lehetséges, hogy az előzőleg az intronba bevitt, a gént elrontó (pl. STOP kodont tartalmazó vagy egyéb módon gén-csapdázó) kazettát a rekombinázzal utólag kivágjuk, gyakorlatilag tökéletesen helyreállítva az eredeti viszonyokat. A feltételes génkiütés sémáját, összevetve az egyszerű génkiütéssel, a 14.13. ábrán szemléltetjük.

Feltételes génkiütés

14.13. ábra: Cre/Lox és Flt/Frt rekombináz-rendszerek használata génkiütéses élőlények előállítására

14.5.5. Genetikai elemek beépítése transzpozonok segítségével

14.5.5.1. A transzpozonok molekuláris biológiája

Gének - többé-kevésbé célzott - bevitelére vagy módosítására nemcsak a homológ rekombinációt vagy a homing endonukleázokat lehet használni. Erre a célra az olyan természetes genetikai paraziták, mint a vírusok és transzpozonok is sokszor megfelelnek. A mobilis genetikai elemeknek nevezett transzpozonoknak számos fajtája létezik: a "szaporodási" (transzpozíciós) mechanizmusuk alapján kéttípus különíthető el: az életciklusuk során RNS-re kiíródó majd DNS-re visszamásolódó retrotranszpozonok (I. típus), valamint a DNS-darabok kivágásával és átvitelével operáló DNS-transzpozonok (II. típus). A további, ritka és komplex típusok tárgyalásától (III - "politronok", IV - "helitronok") itt most eltekintünk. A transzpozonok fontosabb típusait a 14.14. ábra mutatja be:

A retrotranszpozonok viszonylag komplexebb genetikai felépítéssel rendelkeznek, és minden esetben másolás-beillesztés (copy-paste) módszerrel mozognak a genomban. Egy részük esetében (LTR: Long terminal repeat, retrotranszpozonok) az mRNS visszaírása DNS-re, majd annak integrációja a gazda-genomba (a transzpozon-DNS két végén található LTR szekvenciákat felismerő integrázok által) nagyon hasonlít a vírusokéra. A határ a retrovírusok felé semmiképpen sem éles: különösen, mivel egyes retrotranszpozonok genomja burokfehérjéket is kódol. Más részük esetében (non-LTR retrotranszpozonok) a reverz transzkripció és az integráció egyszerre következik be: Ilyen például az emberi genomban is megtalálható LINE1 retrotranszpozon. A LINE1 eredeti (aktív) formája összesen két gént tartalmaz. Az egyikük fehérje-terméke a transzpozon RNS-éhez kötődik, és annak a magba történő visszaszállítását irányítja. A másik fehérje pedig egyszerre rendelkezik DNS-endonukleáz és RNS-függő DNS-polimeráz aktvitással. Így a gazda DNS adott helyen történő hasítása után képes azt a fehérjéhez kapcsolódó RNS-szálról kiegészíteni, bemásolva a transzpozont a képzett résbe.

14.14. ábra: A géntechnológiában alkalmazott transzpozonok legfontosabb típusai

A DNS-transzpozonok szaporodási ciklusa ennél is egyszerűbb. Ezek mindig a kivágás-beillesztés módszerrel mozognak. Ilyenkor a transzpozon által kódolt egyetlenegy fehérje homing endonukleáz aktivitásának köszönhetően képes felismerni és kivágni a transzpozon két, speciális szekvenciákkal (inverted repeat) rendelkező végét. Ezen enzimek a kivágott darab végeihez kapcsolódva a gazda DNS-sét is képesek bizonyos helyeken hasítani (ilyenkor a specificitásuk jóval kisebb, mint a transzpozon kivágásakor). Ráadásul ligáz aktivitással is rendelkeznek, így a transzpozon és a gazda genom törvégeit mindkét oldalon egyesíteni tudják, legalábbis az egyik szálon. A másik szálat a gazda saját javító rendszere fogja kipótolni és bezárni, gyakran megkettőzve ezzel a transzpozon felismerő helyét (ld. 14.15. ábra).

14.15. ábra: DNS-transzpozonok szaporodási ciklusa

14.5.5.2. Genetikai módosítás transzpozonokkal

A transzpozonok jól alkalmazhatóak idegen genetikai elemek célszervezetbe történő bevitelére is, ehhez azonban a következő néhány szempontot kell szem előtt tartanunk. Először is, a transzpozonok beépülése meglehetősen aspecifikus. A felismerő szekvenciáik - mind az RNS, mind a DNS-alapú transzpozonok esetében - általában rövidek, lehetővé téve hogy a transzpozon potenciálisan nagyszámú helyre épülhessen be. Így - bár az integráció nem teljesen véletlenszerű - a bevitt konstrukció előre nehezen megjósolható hely(ek)re fog beépülni. Másrészt, a transzpozíciós aktivitást valahogyan irányítani kell. Az endogén transzpozonok aktivitása általában alacsony - mivel máskülönben a gazdaszervezetet veszélyeztetnék - és sok a csonkolódott vagy másképpen inaktiválódott kópia a genomban. A gyakorlatban ezért inkább olyan transzpozonokat használunk, amelyek nincsenek jelen a célszervezetben: ilyenkor mód van a transzpozáz aktivitás mesterséges megnövelésére, irányított mutációk révén. A vektorunk csak a transzpozícióhoz szükséges felismerő végeket tartalmazza (nem önálló transzpozon). Az enzim(ek)et kódoló (helper) plazmidot külön juttatjuk be a sejtbe, hogy csak átmenetileg legyenek jelen. Petesejtek genetikai módosítása esetén mód van a transzpozáz mRNS-ének mikroinjekciójára is. A transzpozon csak addig mozoghat, amíg az őt mozgató fehérjék jelen vannak, utána stabilan rögzül a genomban - ezzel elkerülhetőek a későbbi, nem kívánatos rekombinációk. De az elem irányított módon bármikor újra mobilizálható, a megfelelő, transzpozázt kódoló plazmid átmeneti bejuttatásával

14.5.5.3. Transzpozonok géntechnológiai alkalmazásai

Új genetikai elemek beépítésére retrotranszpozonok is használhatóak: ilyen például a növényi géntechnológiában alkalmazott Tnt1 (LTR típusú) transzpozon, amely a dohányból (Nicotiana tabacum) ered, és több, magasabb rendű növény genomi módosítására alkalmas. A véletlen beépülése során okozott mutációkkal (inszerciós mutagenezis) például feltérképezhető számos gén működése. De a DNS-transzpozonok egyszerűségüknek köszönhetően nagyobb népszerűségnek örvendenek. Ilyenek például a Tol2, a PiggyBac és a Sleeping Beauty elemek.

A Tol2 transzpozon, amely a japán rizshalból (Oryzas latipes) származik, nem rendelkezik semmiféle szekvencia-preferenciával, ami a beépülést illeti. Viszont előszeretettel integrálódik gerincesek működő génjeinek közelébe vagy belsejébe, ezért jól alkalmazható funkcióvesztéses mutánsok létrehozására (géncsapdázó módszerekkel). A petébe injektált, riporter konstrukciót (pl. GFP-t) tartalmazó plazmid és Tol2 mRNS segítségével génkiütött állatok állíthatóak elő: sőt, még az eredeti gén expressziós mintázata is követhető. Az eltalált gén azonban sokszor csak szekvenálás segítségével azonosítható.

A Drosophilában már régóta ismert P-elem hasonlóképpen használható rovar genomok mutagenezisére, genetikai térképezésére (inszerciós mutagenezis, enhancer trapping módszerekkel). A Sleeping Beauty ("Csipkerózsika") transzpozon viszont egy teljesen mesterségesen létrehozott rendszer. Lazacfélék genomjában található, fosszilis Tcl1/mariner típusú genetikai elemek (kihalt, egykori transzpozonok) alapján lett rekonstruálva, majd óvatos mutációkkal nagy aktivitásúra növelve. Jól használható különféle gerinces genomokba történő (jórészt célzás nélküli) génbevitelre, így a génterápiás próbálkozásokban is egyre gyakrabban alkalmazzák. Indukált őssejtek létrehozására is használható. Rövid célszekvenciája (TA dinukleotid) miatt szinte bárhol beépülhet a genomba, de a Tol2-től eltérően csak ritkán kerül be működő génekbe. A PiggyBac transzpozon eredetileg molylepkékből ered, de a legtöbb állati genom módosítására alkalmas. A felismerő helye (TTAA) rövid, de az integráció mindig precíz (nincs célhely-duplikáció), ellentétben a legtöbb egyéb transzpozonnal. Ezért a PiggyBac rendszerrel beépített elem nyom nélkül vágódik ki a genomból a transzpozáz hatására: így felhasználható reverzibilis génmódosításra is. Hátránya viszont, hogy a PiggyBac rendszer szintén hajlamos a működő gének közelébe beépülni. Hogy az általunk bevitt és az endogén gének interakcióit minimalizáljuk (ha ezt szeretnénk elkerülni), a génbevitelre szánt transzpozon vektorokat újabban inzulátor elemekkel is ellátják. Az inzulátorok gátat vetnek a kromatin módosításának, így az egymáshoz túl közel eső promóterek nem fogják zavarni egymást (ld. 14.16. ábra).

14.16. ábra: Példa a transzpozon alapú vektorokra: új gének bevitelére szánt PiggyBac vektorrendszer