14.6. Géncsendesítés (knock-down) RNS interferenciával

Bár a génkiütés hatékony módszer egy-egy gén működésének befolyásolására, ma már ennél finomabb módszerek is léteznek, amelyek ráadásul kevésbé munkaigényesek. Ezek általában nem genomiális, DNS-szintű módosításokat, hanem az RNS szintjén történő beavatkozást jelentik. A módszereket összefoglaló nevükön RNS interferenciának (RNAi) nevezik. Itt egy természetes jelenséget használunk ki. Már több évtizede ismert, hogy egy-egy fehérjekódoló gént RNS-szinten ki lehet kapcsolni, ha a megfelelő RNS szál komplementerét (antiszensz oligonukleotidot) bevisszük a sejtbe. Rövid, kettős szálú RNS-darabok (siRNS: short interfering RNA) segítségével még nagyobb hatás érhető el. A pontos mechanizmusok feltárása ma már lehetővé teszi a célzott géncsendesítést (knock-down) is. A legtöbb sejt számára a stabil kétszálú RNS teljesen idegen molekula: az őket megfertőző vírusokban, illetve azok életciklusa során viszont gyakran előfordul. A kétszálú RNS-sek lebontására eukariótákban ezért egy speciális rendszer szolgál. Ez alkalmasint lebontja a szervezeten belül keletkező kétszálú RNS-seket is. Az egyes RNS-sekben található hosszú (20-30 nukleotidos) hajtűkanyarok (stem-loop structures) hurkon belüli hasításával normálisan is keletkezhetnek kettős szálú RNS-sek (miRNS: micro-RNA), amelyeknek a természetes génexpressziós szabályozásban van szerepük. A szervezetben a kétszálú RNS-sek feldarabolódnak, és a keletkezett egyszálú darabkák (katalitikus módon) segítik a velük komplementer mRNS-sek hasítását, vagy a transzláció gátlását.

Növények rendelkeznek olyan RNS-függő RNS-polimerázokkal is, amelyek képesek a hasított darabkákat kiegészíteni. Így a felismerő templát szaporodhat, és a plazmodezmákon keresztül az egész szervezetben szétterjedhet, szisztémás RNAi választ hozva létre. Szisztémás RNS-interferencia megvalósulhat a Caenorhabditis elegans nevű fonálféregnél is. Mivel rendelkezik a hosszú, kettős szálú RNS-sek (>400 bázispár) felvételére szolgáló receptorokkal és a szállításukhoz szükséges fehérjékkel, az RNAi válasz az állat kettős szálú RNS-sel való etetésével is kiváltható. Gerincesekben azonban nincs ehhez hasonló szisztémás RNS interferencia: a kétszálú RNS hatása az egyes sejtekre korlátozódik. Emlős sejtekbe természetesen nem juttathatunk be hosszú antiszensz nukleotidokat következmények nélkül: a 25-30 nukleotidnál hosszabb kétszálú RNS-sek ugyanis a természetes immunitás antivirális rendszerét is aktiválják, és a transzláció teljes blokádjához vezetnek. Ezért a mikro-RNS-eknek megfelelő, rövid nukleotidokkal kell a géncsendesítést végrehajtani.

A megfelelő RNS-sek bejuttatására több mód van: transzformálhatunk olyan plazmiddal, amibe erős promóter (pl. U6 splicing alegység snRNS) mögé építjük be a hajtűkanyar-képző szekvenciát. A középső, hurok régió mindig azonos maradhat: az önmagával párosodó szár szekvenciáját kell a cél RNS-hez szabni. Bár az ilyen konstrukciók szekvenálása gyakran problémás (a hurok a DNS-ben is megjelenhet a PCR közben és elakad rajta a DNS-polimeráz), ezeket a rövid hajtű RNS-seket (shRNS: short hairpin RNA) kódoló plazmidokat széles körben alkalmazzák géncsendesítésre (gene silencing). A kis hajtűkanyart többsejtű állatokban a Drosha és Pasha endonukleázok ismerik fel, és vágják ki a környező, hosszabb RNS-szakaszból, akárcsak a természetes miRNS gének esetén. Ezután a Dicer endonukleáz lehasítja a hurkot, így az siRNS valódi dimerré válik. A méretre vágott (nagyjából 21 nukleotid hosszú) siRNS-darabka végül a RISC komplexbe (RNA induced silencing complex) kerül. A komplex magját alkotó Argonaute endonukleáz a két siRNS szál egyikét (guide strand) stabilan megköti, a másik szálat (passanger strand) pedig kiveti. A komplex ezután a megkötött siRNS-szállal párosítható, hosszabb, egyszálú RNS molekulákat keres. Tökéletes komplementaritás esetén az Argonaute endonukleáz az mRNS szálat középen elhasítja. Ezzel megakadályozzaa transzlációt, és további, sejten belüli ribonukleázok szubsztrátjává teszi, amelyek előbb-utóbb teljesen lebontják a hasított mRNS-t. Abban az esetben, ha a vezető siRNS szál és az mRNS közötti bázispárosodás nem tökéletes (a két szál a közepén nem teljesen komplementer) vagy inaktív fehérjéket tartalmazó komplexről van szó (az emlős Argonaute fehérjék közül például egyedül az Ago2-nek van mérhető enzimaktivitása), a hasítás nem megy végbe. A transzláció azonban ilyenkor is gátlást szenved. Az siRNS-sek számos eukarióta élőlényben szabályozzák a transzkripciót (RITS komplex), a transzpozonok expresszióját (PIWI-kötő RNS-sek, piRNA), sőt a kromatin módosítását is. Ezen folyamatok molekuláris szintű részleteit azonban ma még csak kevéssé ismerjük.

Az RNS-interferenciára egy másik lehetőség, hogy szintetikusan előállított siRNS-eket jutattunk a sejtekbe. A tervezéskor csak arra kell ügyelni, hogy az oligonukleotid valóban egyedi legyen (a teljes transzkriptom ellenőrzésével). Gyakorlatilag a célgén bármelyik szakaszát megcélozhatjuk (nem csak a kódoló szakaszt, hanem az 5'- vagy 3'-UTR végeket is). Erre automata tervezőprogramok is rendelkezésre állnak. Bár optimális géncsendesítés néha elérhető akár egyetlen fajta kétszálú RNS-darab bejuttatásával is, általában érdemes legalább 3-4 különféle szekvenciát kipróbálni, hogy a "szerencse kisasszonyt" kiiktassuk a kísérletből. A géncsendesítés sémáját a 14.17. ábrán mutatjuk be.

A géncsendesítés a gyógyszeripar részéről is hatalmas érdeklődésre tart számot: a cél az RNS interferencia alapú terápiák megvalósítása. Ilyenkor nem természetes nukleotidokat, hanem például foszfotioát kötést tartalmazó (általában egyszálú) nukleotid analógokat használnak, amelyek ellenállóak a ribonukleázokkal szemben. Bár a az egyszálú RNS-sekkel nehezebb a RISC komplexet megcélozni (mivel az Argonaute fehérje kötéséhez előbb 5' pozícióban foszforilálódnia kell a nukleotid analógnak), ma már több antiszensz RNS-származékokat használnak sikerrel különféle betegségek kezelésére. Ilyen például a régóta forgalmazott fomiversen (a citomegalovírus IE2 génje ellen, antivirális szerként) vagy a mipomersen (apolipoprotein-B ellen, hiperlipidémia kezelésére). Az RNAi alapú terápiák fejlesztése azonban nem könnyű feladat, mivel a megfelelő nukleotid-analógok gyakran instabilak, továbbá hajlamosak gyulladást és egyéb nem kívánatos (off-target) válaszokat okozni. De az új RNS-analóg gyógyszerek előállításának legnagyobb nehézsége, hogy a testi sejtekbe egyelőre nem tudjuk igazán hatékonyan bejuttatni a megfelelő nukleotid-analógokat.

14.17. ábra: A géncsendesítés sejttenyészetben, RNS interferencia alapú módszerekkel