15. fejezet - Transzgenikus élőlények. Génterápia

Tartalom

15.1. A transzgenikus élőlények típusai és felhasználásuk
15.1.1. Transzgenikus mikrobák
15.1.2. Transzgenikus növények
15.1.3. Transzgenikus állatok az alapkutatásban és a gyógyászatban
15.2. Génterápia
15.3. A transzgenikus élőlények felhasználásának tudományetikai és környezetbiztonsági kérdései
15.4. További olvasnivaló a fejezethez

A genetikailag módosított élőlények (GMO: Genetically Modified Organism) magukba foglalják az összes olyan szervezetet, melyek genetikai anyagát módosították valamely géntechnológiai módszerrel. A transzgenikus élőlény pedig egy olyan GMO, melybe egy másik szervezetből izolált gént juttatunk be, amit eredetileg az nem tartalmazott. Az így „kívülről” bejuttatott, exogén eredetű transzgén öröklődik az utódokban, ha az a csíravonalba került be. Transzgenikus élőlények előállítása sokféle módszerrel történhet, amelyeket az előző fejezet (14. fejezet) részletesen tárgyalt.

Az idegen gén (transzgén) termékét a gazdaszervezet ugyanúgy termeli, ahogy a saját fehérjéit. Az expresszió mértéke a génnel együtt bevitt egyéb DNS szakaszoktól függően (promóter régió, 5’ upstream elemek, 3’ UTR) változhat, illetve szövetspecifikussága is ettől függ. Célunk A transzgén expresszálása mellett a gazdaszervezet génexpressziós mintázatának megváltoztatása is cél lehet. Tágabb értelemben transzgénnek nevezhetünk minden olyan, nem feltétlenül gént kódoló DNS szakaszt, vagy mesterségesen előállított gént, melyeket olyan élőlényekbe vagy vektorokba juttatunk be, ahol azelőtt nem fordultak elő. Praktikussági szempontból elkülönítjük a genomiális transzgéneket a cDNS transzgénektől, mely utóbbiak nem tartalmaznak intronokat és a gén körüli szabályozó régiókat. A kifejezetten nagyméretű klónok tárolására/manipulálására kifejlesztett BAC, YAC és kozmid könyvtárak (ld. 7. fejezet) előállításával a genomiális transzgének szabályozó elemeivel együtt történő klónozása könnyen megvalósítható. A transzgenikus élőlények előállítása új távlatokat nyitott a kutatásban, gyógyszeriparban, mezőgazdaságban és számos egyéb iparágban.

A fejezeten belül először példákon keresztül bemutatunk különböző transzgenikus élőlényeket (növényeket, állatokat, mikróbákat) és a legfontosabb felhasználási területeiket. Röviden kitérünk a GMO-kal kapcsolatos tudományetikai és környezetbiztonsági (biosafety) kérdésekre.

15.1. A transzgenikus élőlények típusai és felhasználásuk

A transzgén gazda és a felhasználásuk lehetőségei alapján célszerű külön tárgyalni a transzgenikus növényeket, állatokat és mikrobákat. A transzgenikus növények fő alkalmazási területe értelemszerűen a mezőgazdaság és élelmiszeripar, bár megjegyzendő, hogy ma már gyógyszerek előállítására is be lehet őket vonni. Transzgenikus baktériumokat használnak gyógyszerfehérjék előállítására, a bioremediációban és a környezeti biotechnológia több más területén is. Röviden összefoglaljuk a transzgenikus állatok szerepét az alapkutatásban, a gyógyszeriparban és a gyógyászatban is.

15.1.1. Transzgenikus mikrobák

A baktériumok voltak az első olyan szervezetek, melyek genetikai anyagát módosították laboratóriumi körülmények között. A transzgenikus mikrobák szerepe ma már a bioremediációban nélkülözhetetlen. A higanyszennyezések eltakarításában például egy olyan E. coli törzs bizonyult hatékonynak, ami egér metallotionein (mt-1) és E. coli polifoszfát-kináz (ppk) géneket tartalmaz dohány 16S riboszomális RNS gén konstitutív promótere mögött. Ezek az enzimek higany rezisztenciát és annak felhalmozódását eredményezik a baktériumban. Egy másik alkalmazásban E. coli DH5α törzs lizátumát használták bioriporterként arzént tartalmazó víz kimutatására. A baktérium plazmidja egy arzén-indukált promótert tartalmaz, amely mögé a luciferáz enzim génjét klónozták be. Arzén jelenlétében a luciferáz szubsztrátja újratermelődik. A baktériumkultúrából szuszpenziót készítettek, amit csövekben liofilizáltak. A teszt kit egy-egy csövéhez vizet adva luminométerrel detektálták a minta lumineszcenciájának, így arzéntartalmának a mértékét.

Humán inzulin termelése E. coli baktériumban

15.1. ábra: Humán inzulin termelése E. coli baktériumban. (A) Baktériumból izolált plazmidot és a humán inzulin génjét (izolált vagy szintetikus) ugyanazokkal a restrikciós enzimekkel hasítjuk, majd a ragadós végeikkel a humán inzulin génjét a plazmidba ligáljuk. Szelekció után a plazmidot a megfelelő E. coli törzsekbe transzformálják, ahol folyamatos a β-galaktozidáz promótere utáni proinzulin transzkripciója és transzlációja. Különböző tisztítási lépések után történik a C-peptid tripszines hasítása, ami az inzulin végleges formáját eredményezi. (B) Az inzulin tisztításához használt HPLC oszlop. (C) Az inzulin termelés folyamata. (a módosított ábra forrása: Walsh, Gary. "Therapeutic insulins and their large-scale manufacture." Applied microbiology and biotechnology 67.2 (2005): 151-159.)

A gyógyászatban is alkalmaznak transzgenikus mikróbákat, rekombináns fehérjék termelésére. Az inzulin az egyik leggyakrabban használt gyógyászati célú fehérje, olcsó és nagy mennyiségű termelése rendkívül fontos. Humán inzulint nagy mennyiségben először Escherichia coli törzsek felhasználásával állítottak elő (a humulin fantázianevű rekombináns inzulint a Genentech cég fejlesztette ki 1978-ban, gyógyszerként az Ely Lilly kezdte forgalmazni 1982-ban). A humán inzulin A és B láncát külön törzs termelte szintetikus nukleotid szekvenciákról, ezeket aztán külön tisztították, majd oxidatív környezetben együtt inkubálták, így a két szál között kialakult két diszulfid-híd kötéssel jött létre az intakt inzulin. Az egyes inzulin láncokat egy lac konstitutív promóter mögé klónozták, a β-galaktozidáz génjével együtt. A pozitív klónokra kék-fehér szelekcióval és ampicillin antibiotikummal szelektáltak. Transzlációt követően a β-galaktozidáz C-terminálisához egy metioninnal kapcsolt inzulint cianogén-bromidos kezeléssel szabadították fel, elhasítva a metionin utáni peptid kötést. Egy másik módszernél a humán proinzulin egyetlen szintetikus szálról íródik át, a polipeptidből pedig tripszinnel hasítják ki a C-peptidet (ld. 15.1. ábra). Rekombináns humán inzulin termelésére élesztőt (Saccharomyces cerevisiae) is használnak. Helyspecifikus mutagenezissel módosított inzulin analógokkal mára már számos eltérő hatóidejű és stabilitású inzulin van forgalomban.

Genetikailag módosított baktériumokkal véralvadási faktorokat, és növekedési hormonokat is előállítanak (ld. 15.1. táblázat). A baktériumok által termeltetett fehérjék jóval biztonságosabbak, mint a korábban alkalmazott módszer, amikor is kadaverekből vonták ki a még le nem bomlott fehérjéket (pl. hasnyálmirigyből inzulint, mely egy cukorbeteget két-három napig lát el). Egyrészt így a szerben jelenlevő kórokozók is továbbjuthattak (AIDS, hepatitis-C, Creutzfeldt-Jakob szindróma), másrészt a megnövekedett igényeket ezekből nem lehetett kielégíteni.

Egyes országok katonai hadviselésének részét képezi a mikrobiális biológiai fegyverek előállítása és esetleges használata. Ezeket a nemzetközi szerződésekben tiltott biofegyverek egy részét transzgenikus baktériumok formájában állítják elő.

15.1.2. Transzgenikus növények

A mezőgazdaságban termesztett transzgenikus növények az egyik leggyakrabban emlegetett példái a genetikailag módosított (GM) szervezeteknek. Az olyan génmódosítások, melyek nagyobb terméshozamot, kevesebb rovarirtószer használatát, nagyobb tápértékű termést vagy betegségeknek ellenállóbb fajtát eredményeznek, számos előnyt jelentenek a mezőgazdaságban. Növények, melyek gyorsabban beérnek, tolerálják a különböző talajszennyezéseket, sót, szárazságot, fagyot vagy egyéb szélsőséges időjárást olyan vidéken is meg tudnak élni, ahol előtte nem, illetve ahol előtte növénytermesztésre nem volt lehetőség. Földünk egyre növekvő emberi populációjának ezek a tulajdonságok a jövőben létfontosságúak lesznek.

Hagyományos növénytermesztők kereszteztek először olyan növényeket, melyek természetes szaporodással nem jöhettek volna létre. Ilyen volt az 1875-ben előállított búza-rozs hibrid, a tritikálé. Hamar rájöttek, hogy a hibrid tartalmazza mindkét faj hasznos tulajdonságait, amire szelektálni lehetett. Az első generációs GM növényeket mutációs szaporítással állították elő, ahol a növények sugárzásnak, illetve vegyszereknek voltak kitéve. Ilyen körülményekkel növelték a mutációs rátájukat, és utódaik közül válogatni lehetett a különböző, stabilan megmaradó és hasznos tulajdonságokra. Ehhez a nem specifikus módszerhez képest a transzgének bevitele egy sokkal pontosabb és szabályozhatóbb módja a kívánt tulajdonságok elérésének.

15.1.2.1. Transzgenikus növények előállítása

Az első transzgenikus növényt 1983-ben állították elő, amikor az aminoglikozid típusú antibiotikumok (pl. kanamicin, neomicin, geneticin) rezisztencia génjét petúnia és dohány növényekbe juttatták be [1]. A kiméra gén a neomicin I-es vagy II-es típusú foszfotranszferáz enzim génjét illetve a nopalin-szintáz gén szabályozó régióit tartalmazta (ld. 15.2. ábra). A neomicin-foszfotranszferáz foszforilációval inaktiválja az aminoglikozid antibiotikumokat, míg a nopalin-szintáz konstitutív promótere biztosítja az állandó expressziót a növényi sejtekben. A kiméra génszakaszt először egy köztes plazmidba klónozták, amiről rekombinációval került be a transzgén egy tumort indukáló plazmidba (Ti plazmid), melyet Agrobacterium tumefaciens talajbaktériumba transzformáltak (ld. 14.4.4. fejezet). Ez a talajbaktérium a természetben is sokféle Ti plazmidot tartalmaz. A baktériummal fertőzve a növényi sejteket, a Ti plazmidból a növényi sejtek genomjába épül be egy DNS-darab (T-DNS), mely tartalmazza a transzgént is. A beépülés célzottan történik, a T-DNS két végén lévő ismétlődő szekvenciák segítségével. A megfelelő plazmiddal transzformált növényi sejtek antibiotikum jelenléte mellett szelektálhatóak.

Agrobacterium-közvetített génátvitel

15.2. ábra: Agrobacterium-közvetített génátvitel. A transzgenikus növények előállításának egyik típusa az Agrobacterium tumefaciens talajbaktériummal történő fertőzés, mely segítségével a növényi genomba beépülő T-DNS-ről történik a transzgén átírása. A módszer jól alkalmazható olyan növényeknél, amit az Agrobacterium hatékonyan képes fertőzni (pl. dohány, paradicsom, burgonya). Szemléltető videó itt nézhető meg.

Az olyan növényeknél, amik nem érzékenyek az Agrobacterium által közvetített folyamatokra, gyakran alkalmazott génbeviteli módszerek a génpuska, a direkt génátvitel protoplasztokba (pl. elektroporációval) és a mikroinjektálásos génbevitel. A protoplaszt (izolált növényi sejt sejtfal nélkül) transzformálása nagyon hatékonyan működik bármely felsorolt fizikai folyamaton alapuló technikával, hiszen nem szükséges biológiai vektor a transzgén közvetítéséhez, így elkerülhetőek a nem-kompatibilis gazda problémák. Homológ rekombinációval pedig specifikusan építhető be a transzgén az ismert növényi genomba. A protoplaszt transzformálásával az egyetlen probléma, hogy a növény regenerációja protoplasztból egy rendkívül kényes folyamat, ami sok problémával jár. A génpuska (ld. 15.3. ábra) számos előnnyel rendelkezik (egyszerű használat, egy lövésből sok transzformált sejt, a legkülönbözőbb szövetek/sejtek transzformálása, stb.), és akkor is hasznosnak bizonyul, amikor más módszer nem működik egy transzgenikus növény előállításánál.

Növények transzformálása fizikai módszerekkel

15.3. ábra: Növények transzformálása fizikai módszerekkel. Protoplasztok, vagy sejtfallal rendelkező növényi sejtek transzformálására is alkalmas a génpuska, vagy a mikroinjektor, ami a DNS-t nagy nyomással juttatja át a sejtfalon és a sejtmembránon.

Az első transzgenikus szója létrehozásánál a génpuska sokkal sikeresebbnek bizonyult, mint az Agrobacterium-közvetített transzformálás. A módszer hátránya, hogy a DNS mennyisége nem szabályozható, illetve a transzformált növényi vonalak kis részénél történik csupán genomiális integráció, a citoszolikus plazmid-transzgének pedig hosszútávon nem fenntarthatóak. Protoplasztok illetve embriók mikroinjektálása növényeknél is alkalmazható, azonban a technológia nehézkesebb, és kevésbé hatékony, mint a génpuska.

15.1.2.2. Transzgenikus növények a mezőgazdaságban és az élelmiszeriparban

Transzgenikus növények első szabadföldi termesztése Franciaországban és az Egyesült Államokban 1986-ban kezdődött, növényirtószerekre rezisztens dohánnyal. 1987-ben alapították az első céget, mely Bacillus thuringiensis baktériumból izolált, rovarra toxikus fehérjét termelő transzgént tartalmazó dohánynövényt állított elő (Bt dohány), szintén Agrobacterium-közvetített technológiával. A dohánymoly lárváját ölő hatást elsőként Bacillus thuringiensis berliner baktériumban termelődő endotoxin (bt2) génjének a bevitelével érték el. A baktérium citoszolikus plazmidjából izolált bt2 vagy cry gén (crystal protein) terméke egy protoxin, mely kristályként jut be a rovar emésztőrendszerébe, itt oldatba kerül, majd proteázok kihasítják az aktív toxint belőle. Később ezen baktériumok plazmidjaiból többféle cry gént izoláltak, így mára a biológiai rovarölő szerek széles spektrumával rendelkezünk (pl. Lepidoptera, Diptera, Coleoptera vagy Hymenoptera fajok ellen). A Bt növények alkalmazhatósága megosztja a kutatókat. Mivel az ilyen növényeket nemcsak a kórokozók, hanem a közelben élő rovarpopulációk is elfogyaszthatják, a toxin ezek populációit is pusztíthatja. Egyesek szerint a Bt kukorica (amelyet ma már nagy területen termesztenek) pollenje áll királylepke populációk, illetve méh kolóniák nagyfokú pusztulásának hátterében, azonban egyikre sincs egyértelmű bizonyíték. Számos kutatás vizsgálja a vad típusú és a Bt kukorica génállományának keveredését is, a transzgének átjutását a vad típusba. Aggodalomra adhat okot az is, hogy egy Bt kukorica a növényvédőszerekben megengedett maximum toxin mennyiség ezerszeresét termelheti.

Az első GM termény az Egyesült Államokban 1994-ben került forgalomba, egy hosszabb eltarthatósági idejű paradicsom formájában (FlavrSavr néven). A génmódosított paradicsomot antiszensz RNS technológiával állították elő. A poligalakturonáz enzim génjét antiszensz RNS szállal csendesítették. A poligalakturonáz a paradicsom érésekor a sejtfalban lévő pektint bontja le, így a paradicsom érés közben puhul, amitől azonban sérülékenyebb lesz, és jobban kitett a fertőzéseknek. Ezért a hagyományos paradicsomot éretlenül szedik le, mivel addig szállítható, amíg kemény és kevésbé sérülékeny. Ez a génmódosított paradicsom azonban nem hozta meg a várt eredményeket. Eltarthatósága megnövekedett ugyan, de éretten mégsem volt elég kemény a szállításhoz, így ugyanúgy zölden kellett leszedni, mint a hagyományosat, ezért vissza is vonták a forgalomból. Szintén egy példa a fogyasztói igények kielégítésére a nem-barnuló alma, mely jelenleg piacra kerülés alatt áll Kanadában és az Egyesült Államokban. Ez a génmódosított alma a barnulást okozó polifenol-oxidáz enzimet csak kis mértékben termeli.

Számos egyéb transzgenikus növényt hoztak forgalomba (paradicsom, krumpli, dohány, kukorica, búza, szója, papaja, citrusfélék, gyapot, repce), melyek ellenállnak a bromoxinil vagy glifozát tartalmú gyomirtóknak, különböző rovarirtóknak, vírusrezisztensek vagy rovarölő hatásuk van.

2000-ben állították elő az első olyan transzgenikus növényt, az aranyrizst, melynek a tápértékét sikerült javítani. Nevét sárgás színéről kapta, mely β-karotin termelésének köszönhető. A cél a főleg Afrikát, Indiát és Ázsia déli részét érintő A-vitamin hiány miatti nagyfokú elhalálozás (és vakság) visszaszorítása volt. Habár humanitárius célokat szolgált, erőteljes negatív visszhangot váltott ki környezetvédők és anti-globalizációs aktivisták körében, elsősorban transzgenikus volta miatt. A β-karotin előállításához, ami az A-vitamin prekurzora, két enzim hiányzik a rizs terméséből (azonban a leveleiben megvan, így az termel is β-karotint): a fitoén-szintáz és a fitoén-deszaturáz (ld. 15.4. ábra).

Az aranyrizs előállítása

15.4. ábra: Az aranyrizs előállítása. A rizs endospermiumban a béta-karotin szintézis útvonala a geranil-geranil-pirofoszfátnál megáll. A pirossal jelölt két enzim bevitele azonban biztosítja a teljes bioszintetikus út lefolyását a β-karotinig. A transzgén konstrukció: RB (right border): T-DNS szekvencia; Glu: rizs endospermium specifikus glutein promóter; SSUcrtI: borsó ribulóz bisz-foszfát-karboxiláz kis alegység tranzitpeptid, a kloroplasztiszban való lokalizáció biztosítására; nos: nopalin-szintáz terminátor; Psy: fitoén-szintáz; Ubi1: kukorica poliubiquitin promóter; hpt: szelekciós marker gén; LB (left border): T-DNS szekvencia. Az ábra alsó részén a vad típusú, az első és második generációs aranyrizs fotója (az alsó ábrarész forrása: www.goldenrice.org/Content2-How/how1_sci.php

Az előbbi génjét (psy) a Narcissus pseudonarcissus növényből, az utóbbit (crtl) az Erwinia uredovora talajbaktériumból izolálták. A két transzgént egy plazmidba klónozták, egy konstitutív, és a magban expresszálódó glutein promóter mögé. A plazmidot higromicin antibiotikum rezisztencia markergénnel történő szelekció után Agrobacteriumba transzformálták, így juttatták a transzgéneket rizs embriókba. Kutatások igazolták, hogy az emberi szervezet képes a rizzsel bevitt β-karotinból az A-vitamin hatékony előállítására. Pár évvel később egy új fajtáját állították elő, az aranyrizs 2-őt, ami 23-szor annyi β-karotint termelt, mint elődje. Ebben a változatban az eredeti aranyrizs Narcissus psy génjét a kukorica psy génjére cserélték, mely enzimaktivitása jóval hatékonyabbnak bizonyult. Mindezeket még egy sor aranyrizs változat követte, melyek E vitamint, vas-, cink-iont tartalmaztak. Annak ellenére, hogy jelenlegi kutatások szerint nem okoz semmilyen allergiát, nem hozható kapcsolatba betegségekkel, és egy bögre rizs fedezi a napi A-vitamin szükséglet 50%-át, még nem engedélyezett a piacra kerülése. Egyes kutatók szerint azonban aggályos, hogy nem tesztelték állatokon, így nem jósolható hosszú távú hatása a szervezet egészére, mivel a β-karotinból (amit a rizs túltermel) származó retinoidok bizonyítottan károsak az egészségre. β-karotin azonban természetes A-vitamin forrásként számos más élelmiszerben is van.

15.1.2.3. Transzgenikus növények a gyógyszeriparban, vegyiparban, a környezeti iparban

A transzgenikus növények szerepe a gyógyszerkutatásban is növekvő tendenciát mutat. Géntechnológiai eszközökkel olyan banánt állítottak elő, melyben hepatitisz-B antigént lehet termelni, illetve olyan dohányt, mely monoklonális ellenanyagot termel HIV ellen. Egyik termék sincs még forgalomban, de a GMO növényekben előállított rekombináns fehérjegyógyszereknek szerepe lehet a jövő személyre szabott gyógyászatában.

Ezen kívül a szerves vegyipar is nagy potenciált lát a transzgenikus növényekben. Sok esetben hatékonyabb a termelés, illetve a növények által előállított anyagoknak kedvezőbbek lehetnek a tulajdonságai, mint a kémiai szintézissel előállítottnak. Számos laboratórium foglalkozik azzal, hogy növényekkel biopolimereket termeltessen, amilyenek különböző műanyagok, a természetes gumi vagy a poliaminok. Szintén hasznos lehet a kémiai szintézisekhez szükséges prekurzorok előállítása növényekkel. A rostfehérjék (selyem, kollagén, elasztin, keratin, glutenin vagy rezilin) repetitív DNS szakaszainak kombinációjával, vagy akár szintetikus szekvenciákkal végtelen sokféle, különböző tulajdonságú biopolimer állítható elő.

A bioremediációban is fontos szerepük van a főleg bakteriális transzgéneket tartalmazó növényeknek. Az Arabidopsis thaliana olyan transzgenikus változatát állították elő, amely bakteriális enzimjei segítségével a robbanóanyagokból származó talajszennyezést képes lebontani. A TNT (2,4,6-trinitrotoluén) vagy RDX (hexahidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin) olyan mérgező xenobiotikumok, melyek a nem tökéletes robbantások után nagy mennyiségben, hosszú ideig jelen vannak a talajban, bejutva az ivóvizekbe is. Az Egyesült Államokban ez a típusú szennyezés igen nagy probléma. Nem transzgenikus növények is képesek a fitoremediációra, fölvéve a szennyezőanyagot, vakuólumokban vagy a sejtfalukban tárolják azt (Vicia faba, Zea mays, Catharanthus roseus), ám lebontani nem képesek. Bioremediáció mikrobákkal is működhet, azonban számos esetben egy adott vegyület lebontásához szükségesek a növényi enzimek, így a két szervezet ötvözése bizonyult eddig a leghatékonyabbnak.

15.1.3. Transzgenikus állatok az alapkutatásban és a gyógyászatban

Az állatok genetikai módosítása egy viszonylag lassú, aprólékos és drága folyamat, azonban az újabb és újabb módszerek megjelenése egyre egyszerűbbé és pontosabbá teszi a technológiát. A genetikailag módosított állatok egy részét kutatási célokból hozzák létre, hogy a specifikusan megváltoztatott gének fenotípusra kifejtett hatását elemezzék. Így még ismeretlen gének funkciója, vagy azok mutációinak hatása, géninterakciók, vagy a génexpresszió helyei feltérképezhetőek. Genetikai módosítással olyan élőlényeket is létrehozhatunk, melyek érzékenyebbek bizonyos vegyületekre, ezt használják ki a gyógyszerkutatásban, hatóanyagok tesztelésénél. Transzgenikus állatok kiválóan alkalmazhatóak modellrendszerként emberi betegségek, illetve azok gyógyításának kutatására is. Más állatokat úgy módosítottak, hogy bizonyos tulajdonságaikat a gyógyászat vagy az ipar hasznosíthassa.

Az első transzgenikus állatot Brinster és Palmiter 1982-ben állították elő, amikor is egy egér megtermékenyített petesejtjének pronukleuszába mikroinjektálással patkány növekedési hormon (GH) transzgént juttattak (ld. 1.5.2. fejezet). A híres egér ikerpár a Nature folyóirat címlapjára is rákerült (ld. 15.5. ábra). 1985-re nyúl, bárány illetve sertés megtermékenyített petesejtjébe is sikerült mikroinjektálással transzgént bevinni. Megjegyzendő, hogy a patkány GH transzgént tartalmazó egér nem azért lett nagyobb, mert a patkány GH az állat méretét szabja meg, hanem az ún. dózishatás miatt, azaz több patkány transzgén épült be véletlenszerűen az egér genomba. A transzgént a nehézfémekkel szabályozott metallotionein gén promótere mögé építették be a rekombináns DNS konstrukcióba.

Az első transzgenikus egér a Nature folyóirat címlapján (1982. dec.)

15.5. ábra: A patkány növekedési hormon transzgént tartalmazó egér (bal) és vad típusú testvére (jobb) a Nature folyóirat címlapján (Vol. 300,1982. december 16 ; a Nature Publishing Group engedélyével)

A későbbiekben, a szomatikus nukleáris géntranszfer alkalmazásával több, mint 10 transzgenikus fajt állítottak elő (ld. 15.6. ábra). Ezzel a módszerrel született 1996-ban az első olyan bárányklón is (Dolly), amely felnőtt szomatikus sejt genomját örökölte, habár transzgént nem tartalmazott. Ezzel bizonyítást nyert, hogy bármely testi sejtünk genetikai anyagából a teljes szervezet klónozható.

Szomatikus nukleáris géntranszfer.

15.6. ábra: Szomatikus nukleáris géntranszfer. A módszer segítségével módosított genetikai anyagú donorsejtek szaporíthatóak. (Forrás: wikipedia.org, GNU Free Documentation License, szerző: Quelle).

15.1.3.1. Xenotranszplantáció és xenogén sejtterápia a gyógyászatban

A szervtranszplantációra várók száma többszöröse a felhasználható humán szerveknek, és szomorú tény, hogy minden évben több ezer beteg hal meg megfelelő szervek hiányában. Ezt az igényt próbálja kielégíteni a xenotranszplantáció, amikor egy nem humán élőlény szervét ültetik be a betegbe. A sertés jó választásnak tűnt a kutatók számára, mivel szerveinek mérete hasonlít az emberéhez, az anatómiája és fiziológiája sem túl különböző, hatékonyan és egyszerűen szaporítható és fenntartható, illetve a technológia adott az immungenetikájának a megváltoztatására. Transzgenikus sertések előállításával a beültetett szerv azonnali kilökődését (HAR: hyperacute rejection response) és a napokkal későbbi akut vaszkuláris kilökődését (AVR: acute vascular rejection) szeretnék elkerülni. A hosszútávú kilökődés elkerülésére egyenlőre csupán az egész életen át tartó immunszupresszánsok szedése jelent megoldást. Bíztató eredményeket mutat a HAR folyamán aktiválódott humán komplement rendszert szabályozó fehérjék termelése az átültetett sertés szervben. Az ember által termelt antitestek felismerik a sertés antigéneket, és az ellenanyag-antigén komplex aktiválja a komplement kaszkádot, ami a membránkárosító komplex (MAC: membrane attack complex) létrejöttéhez vezet. Azonban a komplement kaszkádot szabályozó fehérjék, mint a CD55 (DAF: decay accelerating factor) vagy CD46 (MCP: membrane cofactor protein) meggátolják a MAC kialakulását. Embriók mikroinjektálásával előállítottak DAF és MCP fehérjéket expresszáló transzgenikus sertést, mely sikeresen meggátolta az átültetett sertésvese kilökődését főemlősökben (15.7. ábra). A kilökődés megakadályozására egy másik stratégia, hogy meggátolják a sejtfelszíni antigének kifejeződését. Az antigének főleg az 1,3-α-galaktoziltranszferáz aktivitása révén létrejövő 1,3-α-gal-epitópok. Az α-gal allélt homológ rekombinációval ütötték ki sertés embrionális fibroblaszt sejtekből, ami aztán nukleáris transzferrel került embriósejtekbe, és erre a génre nézve egészséges KO (knock-out) malacokat eredményezett.

Xenotranszplantációra használt transzgenikus sertés előállítása

15.7. ábra: Xenotranszplantációra használt transzgenikus sertés előállítása. A CD55 fehérjét termelő génszakasz előtt egy citomegalovírus promótere áll (PCMV), ami biztosítja a gén transzkripcióját már az élet korai szakaszában. A poliadenilációs szakasz (PA) után, és a promóter szakasz előtt találhatóak a restrikciós enzimek hasítóhelyei (Pvu I, Asp 1). (a módosított ábra forrása: Niemann & Kues, 2003, Application of transgenesis in livestock for agriculture and biomedicine. Animal Reproduction Science, 79(3), 291-317)

A szervtranszplantáció mellett a xenogén sejtterápia is biztató eredményekkel szolgál a gyógyászat terén. A xenotranszplantációnál megismert, megfelelő transzgenikus állatokból (sertés, marha) történő sejtizolálás és beültetés megoldást nyújthat a humán őssejtterápia mellett a különböző betegségek, rendellenességek vagy sérülések miatti elhalt szövetek regenerációjára. A xenogén sejtterápia egyes betegségek esetében már klinikai tesztelés előtti fázisban van. Transzgenikus sertés embrionális idegsejteket Parkinson illetve Huntington kórban szenvedő betegek agyába transzplantáltak, ahol azok dopaminerg neuronokká és glia sejtekké alakultak. A sertés eredetű neuronok a beültetés helyéről kiindulva kiterjedt axonhálózatot alakítottak ki a páciens agyában. Számos más példa létezik arra, hogy idegen eredetű sejtek képesek visszaadni a gazdaszervezet egyes szöveteinek funkcióját. Transzgenikus sertés májsejtek transzplantáció után a máj szöveteibe vándoroltak, és ott integrálódva működő LDL receptorokat expresszáltak, ezzel csökkentve egy magas koleszterinszintű nyúltörzsben a szérum koleszterinszintjét 30-60%-kal. A használt nyúltörzs a homozigóta öröklődésű hiperkoleszterinémia állati modelljeként szolgál. Ezzel el is érkeztünk a transzgenikus állatok következő rendkívül fontos felhasználásához, az emberi betegségek állati modelleken keresztül történő kutatásához. A donorsejtek sikeres genetikai módosítása, a xenogén sejtterápia alkalmazása emberi betegségeket modellező állattörzseken sikeres terápiás megoldásokhoz vezethet a humán gyógyászatban.

15.1.3.2. Emberi betegségek állatmodelljei: KO (knock-out) egerek

Knock-out (KO, génkiütött) egerek előállítása mára már általános módszerré vált, mellyel egy gén részét/egészét távolítják el vagy helyettesítik egyéb DNS szekvenciával (ld. 14.5.3. fejezet) A gén kiütésével vizsgálni lehet annak funkcióját, fenotípusát, illetve „utánozni” lehet funkcióvesztéses mutációkon alapuló emberi betegségeket. Az ember és egér génjei között nagyfokú a hasonlóság, ezért a különböző KO egerek jellegzetességeit vizsgálva, illetve a kialakult tünetegyüttesre kezeléseket kidolgozva közelebb kerülhetünk számos genetikai hátterű betegség gyógyításához. A legkülönbözőbb ráktípusok, túlsúlyosság, szívelégtelenség, cukorbetegség, köszvény, Parkinson kór, drogfüggőség, öregedés mind olyan területek, ahol a különböző KO egerek nagy szolgálatot tettek a kutatóknak. Az első KO egeret 1989-ben állították elő Capecchi, Evans és Smithies (ld. 1.5.2. fejezet). Mára már több ezer KO vagy transzgenikus egértörzs létezik (MKMD: Mouse Knock-out and Mutation Database), és évente több millió egeret használnak fel különböző kutatásokhoz.

A célzott génkiütés, mint gén targeting módszer alapjait a 14. fejezetben részleteztük. Ebben a fejezetben a KO egerek létrehozásának a lépéseit foglaljuk össze (15.8. ábra):

  1. A kiütni kívánt gént (célgén) génkönyvtárból izolálják, majd a gént módosítják (deléció, inszerció, specifikus/random mutagenezis). A génszakaszhoz egy markergént is fuzionáltatnak, ami általában egy antibiotikum vagy toxin rezisztencia génje, de lehet egyéb detektálható változással járó géntermék is (szín, fluoreszcencia). A legegyszerűbb, ha homológ rekombinációval kicserélik a markergént a kiütni kívánt génnel.

  2. Egér (fehér) blasztocitából őssejtet (ESC: embyonic stem cell) izolálnak, amit in vitro tenyésztenek.

  3. A módosított génszakaszt elektroporációval juttatják be az őssejtekbe, ami homológ rekombinációval épül be a sejtek genomjába. A sikeres rekombinációs esemény igen ritka, ezért annak az esélye, hogy az őssejt anyai és apai kromoszómája is tartalmazza a módosított gént, igen csekély. Így a legtöbb sejt, ahol a rekombináció megtörtént, heterozigóta lesz erre a génre nézve.

  4. Azokra a sejtekre, amelyek genomja tartalmazza a módosított gént, markergénnel szelektálnak antibiotikum/toxin jelenlétében, illetve a fluoreszcens jel alapján különböztetik meg őket.

  5. A KO gént tartalmazó sejteket egy másik egér (fekete) blasztocitájába visszajuttatják. Így a blasztocita kétféle sejtet tartalmaz: a módosított fehér egérből származót, és a nem módosított fekete egér eredetűt. A blasztocitát ezután beültetik egy álvemhes egér pótanya uterusába, ahol kifejlődhet a kiméra utód. Az utód bundáján valóban látható, hogy kiméra, a fehér egér eredetű sejtek utódai fehér bundát eredményeznek, míg a feketéé feketét.

  6. Néhány kiméra gonádja is lehet fehér egér leszármazott, így az azok által termelt ivarsejtek tartalmazzák a KO gént. Ezért ha a kiméra egereket pároztatják vad típussal, lesz olyan utód, ahol egy kópiában ugyan, de meglesz a KO gén. Ezek az egerek fehérek, de heterozigóták a KO génre nézve.

  7. Már csak keresztezni kell a heterozigóta egyedeket egymás között, hogy kapjunk homozigóta egereket a KO génre nézve, ahol egyáltalán nincs funkcionális géntermék.

Ezzel a módszerrel készült egy örökletes törpeséggel járó betegség, a Laron szindróma állatmodellje is. A Laron szindróma hátterében a növekedési hormon receptorának (GHR: growth hormone receptor) defektusa áll, aminek következtében a növekedési hormonokra nem reagál a páciens. A GHR funkcióvesztésének okát emberben nehéz vizsgálni, aminek etikai és gyakorlati okai is vannak. Homológ rekombináción alapuló célzott génkiütéssel ezért létrehozták a Laron egereket, melyekben a GHR és GHR-kötő fehérje génjét ütötték ki. Az egerek fenotípusa tipikus Laron szindróma jellegzetességeket produkált (születés utáni növekedési hibák, majd törpeség, a GHR és kötőfehérjéjének hiánya, csökkent koncentrációjú inzulin-szerű növekedési faktor I és megnövekedett GH szint). Ezt a modellállatot azóta az öregedés kutatásához is használják, mivel azt figyelték meg, hogy a GH rezisztens állatok életideje meghosszabbodott.

15.8. ábra: Knock-out egerek előállítása. (Forrás: wikipedia.org. GNU Free Documentation licence; szerző: Kjaergaard)

Egy gén kiütése nem minden esetben eredményez életképes utódokat, a KO egérgének 15%-a letális, ezért legjobb esetben is csak embrionális korban tanulmányozható a hatás. Előfordulhat az is, hogy hiába nagyon hasonló az egér genomja az emberéhez, egy gén funkcióvesztése más fenotípust eredményez. Számos betegség modelljét egér helyett patkányra dolgozták ki, mely szaporítás terén lényegében azonos tulajdonságokkal rendelkezik, azonban jóval nagyobb, ami miatt könnyebb operálni vagy vért venni tőle. Fontos megjegyezni, hogy fiziológiai szempontból is ideálisabb választás a patkány. Pulzusa például csaknem a miénkkel azonos, míg az egér szíve 5-10-szer gyorsabban ver. Detoxifikáló enzimjei is jóval közelebb állnak hozzánk, ezért a potenciális gyógyszerek farmakológiai hatását és toxikusságát jobb patkányon vizsgálni. Mindezek ellenére az egérmodellek is rendkívül fontosak, hisz több rágcsáló modelltörzs birtokában jobban meg tudjuk becsülni, hogy az észlelt fenotípus rágcsáló-specifikus, vagy általános az emlősökben.

Az első transzgenikus patkányt azonban csak 2008-ban sikerült létrehozni, melynek fő oka, hogy a KO egerek előállításához használt technológia patkánynál nem működött. Mivel a rekombinációs események gyakorisága igen kicsi, a kutatók egyszerűen nem találtak olyan embrionális őssejteket, ahol ez megtörtént volna. Mivel a szomatikus nukleáris transzfer módszer sem eredményezett KO patkányokat, maradt a kémiai mutagenezis, amikoris N-etil-N-nitrozourea (ENU) injektálásával random mutációkat indukáltak. Az ENU etil-csoportja csoporttranszfer reakcióval a DNS oxigén és nitrogén gyökeire kerül, ami mismatch bázispárosodást eredményez. Az ENU-val injektált hímet vad típusú nősténnyel pároztatták, hogy mutáns utódokat kapjanak. Az ENU mutagenezis körülbelül egy mutációt okoz bármely génre nézve minden 200-700-adik ivarsejtben. Annak ellenére, hogy az ENU mutagenetikus hatása nagy, mivel kicsi a penetranciája, így csupán körülbelül 500 gén mutálódik el egy hímben, és az összmutációk csak nagyon kis hányadának van fenotípusos hatása. AZ ENU módszerrel előállított mutációk feltérképezése igen nehézkes, pénz- és időigényes, ezért ma már nem nagyon használják. Az áttörést a transzgenikus patkányok előállításában a Zn-ujj nukleázok (ZFN: zinc finger nucleases) és a transzkripciós aktivátor-szerű effektor nukleázok (TALEN: transcription activator-like effector nucleases) jelentették, amik a DNS kettős szálán szekvenciaspecifikus hasításra képesek, így segítik a genom célzott módosítását (ld. 14.5.2. fejezet). A hasítással aktiválják a DNS-javító mechanizmusokat, a homológ rekombinációt és a törött végek közvetlen összeragasztását. A nem homológián alapuló közvetlen ligálás a törött végeknél általában mutációkhoz vezet.

A mobilis genetikai elemekkel (retrotranszpozonok, transzpozonok) előállított mutagenezis bár random és nem célzott, mégis alapvető eszköze a transzgenikus emlősök előállításának. Előnye, hogy a gének teljes kiesését eredményező mutagenezis egyenesen az ivarsejtekben történik, a bevitt mutáció pedig stabilan fenntartható. A mutációk továbbá könnyen feltérképezhetőek, így a KO patkányokból történő könyvtárak létrehozása viszonylag egyszerű feladat. KO vonalak és szövetspecifikus CRE-rekombinázt expresszáló patkányok pároztatásával feltételes (kondicionális) mutációkat is létre lehet hozni (további részleteket ld.14.5.4. fejezet).

A rágcsálók fiziológiája, anatómiája, életideje sok esetben jelentősen eltér az emberétől, ami miatt számos betegség modellezéséhez nem megfelelőek. Lassú lefolyású ráktípusokhoz, illetve neurodegeneratív betegségekhez a sertés, bárány vagy marha jobb modell, mivel velük a betegségek hosszabb ideig tanulmányozhatók.

Egy ritka szembetegség (PR: retinitis pigmentosa) sertésmodelljét, melyre a fotoreceptorok korai elhalása jellemző, mikroinjektálással hozták létre. A transzgenikus sertésmodell mutáns rodopszint expresszál, ami hasonló fenotípust eredményez az embernél megfigyelthez. A létrehozott modelltörzs segítségével lehetővé vált a betegség kezelésének folyamatos fejlesztése.

Míg a transzgenikus sertések igen elterjedtek az egyes humán betegségek modellezésében, addig a transzgenikus kutya, macska vagy főemlősök előállítása csak nemrégiben vált lehetővé. Az első transzgenikus kutya 2009-ben született, retrovírus-mediált géntranszferrel. A transzgén egy tengeri szellőrózsa piros fluoreszcens fehérjéje volt, mely random integrálódott a kutya fibroblaszt sejtjeibe. Ezután a fibroblaszt sejtekből szomatikus nukleáris transzferrel a transzgént petesejtbe juttatták, amit osztódás után ültettek be pótanyákba. A kutatók most azon dolgoznak, hogy a kívánt inszerciót specifikus helyre lehessen bevinni. Ha ez sikerül, akkor következő lépésként ösztrogén receptor KO kutyákon tanulmányoznák a hormon termékenységre gyakorolt hatását. Ugyanebben az évben, mikor az első transzgenikus kutya is született, japán kutatók bejelentették, hogy vírus-közvetített géntranszferrel előállították az első stabil transzgenikus főemlős törzset. A transzgenikus vonal sikeresen szaporodik, és utódai is tartalmazzák a transzgént, ami egy zöld fluoreszcens fehérje (GFP: green fluorescent protein). Az újonnan előállított főemlősökben az egéren nem tanulmányozható betegségeket szeretnék vizsgálni, mint amilyen a Huntington kór vagy az infarktus. 2011-ben amerikai-japán kutatók sikeresen hoztak létre GFP transzgént tartalmazó macskát, mely a későbbiekben modellje lehet az emberi HIV okozta AIDS betegségnek, mivel a macska immundeficiencia vírus (FIV: feline immunodeficiency virus) a HIV rokona.

15.1.3.3. Transzgenikus állatok az élelmiszeriparban

Annak ellenére, hogy a transzgenikus növények jóval elterjedtebbek az élelmiszeriparban, számos példát találunk a GM állatok felhasználására is. Az ilyen, géntechnológiai módszerekkel módosított állati termékek egy része arra szolgál, hogy az adott termék emberi egészségre gyakorolt pozitív hatását fokozzák. Ilyen a csökkentett koleszterin tartalom, magas vérnyomást csökkentő angiotenzin-konvertáló enzim inhibitorok vagy immunrendszert stimuláló peptidek jelenléte az ételben. A húsipar nagy felfedezettje egy olyan transzgenikus sertésvonal, ami nagyobb arányban termel telítetlen zsírsavakat, mint telítetteket, így húsa egészségesebb, és fogyasztásával csökkenthető az infarktus vagy a szívproblémák veszélye. Transzgenikus marhával a tejtermékek legkülönbözőbb változatait lehet előállítani: zsírszegény tej (lipidanyagcsere enzim modulációjával), hipoallergén tej (β-laktalbumin gén kiütésével), laktózmentes tej (α-laktalbumin gén kiütésével), vagy csecsemőtej (laktoferrin túltermeléssel). A tejben található egyik fontos összetevő, a kazein különböző típusai határozzák meg a tej fizikokémiai tulajdonságait. Ezért a kazein a tejminőség javításának az egyik fő célpontja. Az egyes összetevők változtatásának hatása, illetve mellékhatásainak mértéke egérmodelleken jól követhető.

15.1.3.4. Transzgenikus állatok a gyógyszeriparban: humán fehérjék előállítása

A terápiára használt humán fehérjék emberi vérből vagy szövetekből történő előállítása kis hatékonyságú, drága, időigényes és magában rejti a humán kórokozók terjesztésének veszélyét. Rekombináns baktérium vagy sejtkultúrák felhasználásával egyszerűbb a gyógyszerfehérjék termelése. Hátrányuk, hogy a baktériumok csak viszonylag egyszerű fehérjék termelésére képesek, a poszt-transzlációs módosításokra alkalmas mechanizmusok pedig limitáltak. Megfelelőnek bizonyul erre a célra többféle transzgenikus állat, a bárány, kecske, marha, sertés, sőt a nyúl emlőmirigye, mellyel sok fehérje előállítható. A rekombináns fehérje az állatból a tejjel távozik, így tisztítása sem jelent különösebb problémát. Ezen állatokban a glikozilációs mintázatok és a poszt-transzlációs módosítások is megfelelőek. Rekombináns fehérjék szekréciójára a tej mellett a vért, a vizeletet illetve egyéb testnedveket is felhasználnak. Ígéretes lehetőség gyengén immunogén antigének elleni ellenanyag termeltetésére neonatális Fc-receptorra transzgenikus állatok (egér, nyúl) létrehozása (az ImmunoGenes cég fejlesztése).

Számos rekombináns fehérjét termelnek emlőmirigy specifikus promóterrel rendelkező génkonstrukciókkal. Az így termelt α-antitripszin, antitrombin-III vagy szöveti plazminogén aktivátor (TPA) jelenleg klinikai kipróbálás alatt áll. Transzgenikus nyulak emlőmirigye által termelt α-glükozidázt sikeresen alkalmazták a Pompe-kór kezelésére. Ez a betegség a glikogénraktározás rendellenességeihez vezet és halálos két éves kor alatt, amennyiben a beteg nem kap α-glükozidázt. Egy másik esetben biológiailag aktív laktoferrint állítottak elő transzgenikus szarvasmarha tejében, amivel profilaxist illetve számos fertőző betegséget lehet kezelni. A géntechnológia úton (baktériumban, élesztőben, növényi és állati sejtekben) előállított terápiás célú fehérjék száma gyorsan növekszik. A 15.1. táblázatban összefoglaltuk a legfontosabbakat (részben az FDA által jóváhagyott, részben klinikai kipróbálás, részben még kísérleti stádiumban vannak)

A különböző baktériumok növekvő antibiotikum rezisztenciájával párhuzamosan egyre nő az újfajta antimikrobiális anyagok iránti igény. A kationos antimikrobiális peptidek (AMP) tulajdonságai igen sok elvárásnak megfelelnek: széles hatásspektrummal bírnak, mind a Gram+, mind a Gram- baktériumokat gyorsan elpusztítják, a klasszikus rezisztencia gének nem hatnak rájuk, illetve különböző állatmodellekben is aktívnak bizonyultak. Az AMP specifikusan a bakteriális sejtmembránnal kerül közvetlen kapcsolatba, amiért a rengeteg anionos foszfolipid és az alacsony membránpotenciál a felelős. Úgy gondolják, hogy az AMP a membránt fizikailag roncsolja, illetve intracelluláris molekulákkal is kapcsolatba lép. Az élővilágban sokféle AMP-t fedeztek már fel, azonban ezek emberre akár toxikusak is lehetnek (pl. rovar AMP).

A bemutatott sikerek ellenére azt is fontos megjegyezni, hogy jelenleg nem minden fehérjét lehet transzgenikus állatok felhasználásával előállíttatni. Az eritropoetin termeltetésére irányuló erőfeszítések például mind szarvasmarhában, mind nyúlban kudarcot vallottak, utóbbi esetben a géntermék toxicitása miatt. A példából látszik, hogy a technológiának jelenleg még vannak korlátai.

15.1. táblázat: Rekombináns fehérjék terápiás használatra

Egy érdekes új fejlesztés a transzkromoszomális állatok létrehozása. A humán immunglobulin teljes nehéz és könnyűlánc szekvenciáját tartalmazó humán mesterséges kromoszómát (HAC: human artificial chromosome) marha fibroblaszt sejtekbe juttatták, amely sejteket ezután nukleáris transzferre használtak. A transzkromoszomális utódok a vérükben humán immunglobulint termeltek. Egy ilyen rendszer nagy előrelépés lehetne a humán poliklonális ellenanyagok termelésében. Szintén ígéretes génterápiás kísérletek folynak a Duchanne izomdisztófia (MDM) HAC-vektorral történő „génjavítására”. Az még a jövő kérdése, hogy az extra kromoszóma mennyire marad fenn a következő generációkban, és mennyire stabil a róla történő expresszió.

15.1.3.5. Transzgenikus állatok a környezetvédelem szolgálatában

Az Enviropig néven elhíresült transzgenikus sertést környezetvédelmi okokból hozták létre. A gabonafélékben található foszfort a sertés nem képes lebontani, így az nagy mennyiségben jut a talajba, illetve ivóvizekbe az ürülékkel együtt távozva. A gazdák eddig foszfort bontó fitáz enzimet is tartalmazó takarmány vásárlására voltak kötelezve, hogy csökkentsék környezetük foszfát szennyezését. Az Enviropig tartalmazza a fitáz gént, ami az állat nyálában termelődik. Az eredetileg E. coli baktériumból származó fitáz gént egy egérből származó konstitutív promóter mögé klónozták be, amit a sertés kromoszómájába mikroinjektálással juttattak be. A módszerhez nem volt szükség virális géntranszferre vagy marker génre, a transzgén a genom egy specifikus helyére épült be, ahol stabilan fennmaradt.