16. fejezet - Irányított evolúciós technikák

Tartalom

16.1. Az irányított evolúciós megközelítésről általában
16.2. Könyvtárkészítési technikák
16.2.1. PCR alapú könyvtárkészítési eljárások
16.2.2. Helyspecifikus mutagenezisen alapuló eljárások
16.3. Szelekciós eljárások
16.3.1. In vitro szelekciós módszerek
16.3.2. A fág-bemutatás
16.3.3. Rekombináns fehérje könyvtár bemutatása és szelekciója élő sejtek felszínén
16.4. További olvasnivaló a fejezethez

A molekuláris biológiai módszerek fejlődése lehetővé tette a gének klónozását és az irányított mutagenezist, azaz egyes aminosavak célzott kicserélését, minek köszönhetően ma már a fehérjék aminosav sorrendje szabadon változtatható. A kutatók mutagenezisen alapuló technikák sorát fejlesztették ki. A fehérjék vizsgálatának klasszikus, fehérjemérnöki megközelítése egyedi fehérje-mutánsok vizsgálatán alapul. Az ilyen vizsgálatok során a fehérje egy vagy néhány pozíciójában megváltoztatják az eredeti aminosavat, majd ezeknek a mutáns fehérjéknek a tulajdonságait hasonlítják össze a természetben is előforduló, úgynevezett vad típusú fehérjével. A mutációk szerkezetre és funkcióra gyakorolt hatásán keresztül igyekeznek a vad típusú aminosavak szerepét feltárni. Hamar kiderült azonban, hogy a lehetséges változatok nagy száma miatt az összes variánst nem lehet előállítani. A fehérje minden pozíciót érintő teljes feltérképezésének gyakorlati akadályai vannak, már egyedi mutánsok vizsgálata esetén is, a mutációk kombinációjáról nem is beszélve. A sok egyenkénti mutáns előállítása, tisztítása és vizsgálata igen idő- és költségigényes. A vizsgálatok eredményei alapján felmerülő újabb kérdéseket megválaszolni, a hipotéziseket alátámasztani csak egy, de általában több újabb mutáns előállításával és vizsgálatával van mód.

Áttörést jelentett az irányított evolúciós módszerek megjelenése. Ezek a módszerek olyan esetekben alkalmazhatók egyszerűen, amikor a vizsgálat tárgya valamely adott molekulához szelektíven kötődő fehérje. Az evolúció működésbe lépésének mindössze néhány alapvető feltétele van: a szaporodás képessége, az öröklődés (az utód hasonlít a szülő(k)re) és a változatosság (az utód nem tökéletes másolata a szülő(k)nek). Abban a rendszerben, amelyben a feltételek teljesülnek, evolúciós folyamatok indulnak be abban az esetben, ha a tagok eltérő tulajdonságai befolyásolják azok szaporodási sikerét, azaz a rátermettséget. Egy ilyen rendszerben az adott környezeti feltételek között legjobban teljesítők szaporodnak a legnagyobb mértékben, utódaik aránya a következő generációban nagyobb lesz (ld. 16.1. ábra). Az ábrán bemutatott rendszerben a kiinduló helyzethez képest az A egyedek aránya megnőtt, és B mutációjával megjelent a C típus.

16.1. ábra: Az evolválódó rendszerek általános ábrázolása

A folyamat, ha hosszú idő (illetve elegendően sok szaporodási ciklus) áll rendelkezésre, a változatok bámulatos sokféleségét képes létrehozni, mely változatok rendelkeznek az adott környezetben való fennmaradáshoz és a tovább szaporodáshoz szükséges adaptációkkal. Erre a földi élőlények diverzitása a látványos bizonyíték. Az irányított evolúciós módszerek az evolúcióhoz hasonlóan működnek, és a természetben előforduló folyamatokat utánozva segítik a kutatót. Működésük a fehérje nagyszámú egyedi mutánsának, a változatosságnak (variánsok könyvtára) előállításán és az így létrehozott sokaságból a szelektív kötésen alapuló szelekción nyugszanak. A kutató dönti el, hogy a fehérje mely részeinek mekkora változatosságát hozza létre, és, hogy milyen tulajdonságra szelektál, innen az irányított jelző.

16.1. Az irányított evolúciós megközelítésről általában

Az irányított evolúciós technikák nagy előnye, hogy a mutánsokat nem kell egyenként előállítani, tisztítani és vizsgálni. A génkönyvtárat különböző, PCR-en és/vagy degenerált szintetikus oligonukleotidok használatán alapuló módszerek segítségével, egy reakcióban állítják elő. A génkönyvtárat úgy fejezik ki fehérjék formájában, hogy azok a génjeikkel fizikai kapcsolatban maradnak. A szelekció során a kötőpartnerrel összehozva kiválaszthatók a sokaságból azok a fehérje változatok, melyek teljesítik a szelekciós feltételeket. Egyedi mutánsok vizsgálata helyett ezen, funkcióra szelektált gének szekvenciájának analízisével deríthető ki, hogy a vizsgált fehérjén milyen aminosavak szükségesek vagy alkalmasak a funkció ellátására. A könyvtárkészítés és a szelekció során tulajdonképpen egy térben zajlik sok millió egyedi kísérlet, melyeket egyenként képtelenség volna elvégezni. Így sokkal több mutáns megvizsgálására van lehetőség, mint egyedi változatok előállítása esetén. A módszer általános sémáját a 16.2. ábra ismerteti.

16.2. ábra: Az irányított evolúciós eljárások általános ábrázolása

A könyvtárkészítés során a mutációk aránya és típusa bizonyos határok között szabadon, illetve a céloknak megfelelően választható meg. A szelekciós feltételeket, a szelekció körülményeit szintén a vizsgálat céljától függően lehet beállítani. Ennek köszönhetően lehetőség van nagyobb affinitású kölcsönható partnerek, vagy enzimek esetén nagyobb katalitikus aktivitású változatok előállítására éppúgy, mint az eredetitől eltérő partner kötésére, illetve átalakítására képes fehérjék kifejlesztésére. Az így előállított, korábban nem létező fehérjék, illetve enzimek egy részét ipari folyamatokban vagy terápiás célokkal használják, ami a megközelítés óriási gyakorlati jelentőségét is mutatja.

Az irányított evolúciós módszereknek is vannak ugyanakkor korlátai. A könyvtárkészítési és szelekciós eljárások csak bizonyos varianciájú könyvtárak áteresztésére képesek, nagyobb könyvtár alkalmazása esetén könnyen elveszhetnek véletlenszerűen olyan változatok is, melyek teljesíthetnék a szelekciós feltételeket. Olyan könyvtár létrehozásának, ami egy adott hosszúságú polipeptid összes lehetséges variánsát tartalmazza, már elvi akadályai is lehetnek a lehetséges variánsok számának exponenciális növekedése miatt. Egy 60 aminosavból álló polipeptid esetében a lehetséges variánsok száma 2060, ami meghaladja az univerzumban létező elemi részecskék számát. Ezért ezen módszerek alkalmazásakor sincs lehetőség a fehérje összes aminosav pozíciójának teljes körű vizsgálatára. Vagy az egyes pozíciókban előforduló aminosavak számát, vagy a vizsgált pozíciók számát korlátok közé kell szorítani. A módszerek alkalmazhatóságát korlátozza az is, hogy segítségükkel csak más molekulához szelektíven kötő fehérjék vizsgálhatók, melyeknek a kötőpartnere is ismert.