16.2. Könyvtárkészítési technikák

16.2.1. PCR alapú könyvtárkészítési eljárások

16.2.1.1. Hibát ejtő (error-prone) PCR

A PCR alapú könyvtárkészítés legegyszerűbb módja az úgynevezett hibát ejtő (error prone) PCR alkalmazása, amelyet részletesen ismertettünk a 11.1.2. fejezetben. A hibát ejtő PCR olyan eljárás, melynek során gyakrabban hibázó DNS-polimeráz enzim használatával, a reakciókörülmények szuboptimális, hibára hajlamosító beállításával, vagy éppen egyenlőtlen arányban adagolt nukleotidokkal a vizsgálni kívánt fehérje génjének PCR-rel történő felszaporítása során véletlenszerű pontmutációkat tartalmazó kópiákat tartalmazó génkönyvtárat állítanak elő. Ezt követően a mutánsokat is tartalmazó könyvtárat fehérje formában kifejezik, és egy megfelelő szelekciós módszerrel kiválaszthatják a sokaságból a megváltozott funkciójú fehérjéket. A kiválasztott fehérjék ezután tovább vizsgálhatók. Megállapítható a mutáció vagy mutációk pontos helye és típusa, valamint a funkcióra gyakorolt hatása. A módszer alkalmazásában nehézséget okoz például a helyes mutációs ráta megválasztása, ugyanis a mutációk között a káros, például teljes funkcióvesztést okozó mutációk sokkal gyakoribbak, mint a hasznosak, amelyek a funkció kimutatható megváltozásával járnak. Magas mutációs ráta esetén a sok káros, például a térszerkezetet torzító mutáció elfedheti a vizsgálat szempontjából hasznos, megváltozott funkciót eredményező mutációk hatását, míg túl alacsony mutációs ráta esetén a vadtípus dominanciája miatt nehezebb a mutánsokat megtalálni. A pontmutáción alapuló technika előnyösen megváltozott specifitású fehérjék előállítására kevéssé alkalmas, ugyanis a mutációk véletlenszerűen jelennek meg, és egy lényeges funkcionális ugrás eléréséhez valószínűleg több aminosav együttes megváltozására van szükség.

Bár nem PCR technika használatán alapul, de szintén random mutációkat tartalmazó könyvtár előállítására alkalmas módszer a hibára hajlamosított E. coli sejtek használata (ld. 11.1.1. fejezet). Ezek a sejtek a DNS hibajavítás bizonyos fehérjéi, vagy proofreading aktivitással rendelkező DNS-polimerázok mutáns változatait hordozzák, ezért ezekben a sejtekben a DNS replikáció sok hibával zajlik.

16.2.1.2. „Szexuális” PCR

A fejlettebb PCR alapú eljárások a könyvtárkészítés során a homológ rekombinációval analóg folyamatokat használnak ki. Számítógépes szimulációk igazolják, hogy a rekombináció képességével rendelkező rendszerek gyorsabban evolválódnak és „robosztusabbak”, vagyis külső behatásokra (esetünkben káros mutációkra) ellenállóbbak, mint azok, melyek rekombinációra képtelenek. A rekombináció biztosítja a különböző egyedekben létrejött mutációk keverését. A rekombináció és szelekció együttes megvalósulása lehetővé teszi a kedvező mutáció kombinációk kialakulását, valamint megakadályozza a káros mutációk elszaporodását. A fent leírt hibára hajlamos PCR, valamint a később bemutatásra kerülő helyspecifikus mutagenezisen alapuló technikák nem rendelkeznek a rekombináció képességével, ellentétben a következőkben ismertetett „szexuális PCR” módszerrel (ld. 16.3. ábra).

A szexuális PCR vagy DNS keverés technika a természetes vagy mesterséges változatosság homológ rekombinációval történő keverését imitáló in vitro módszer, ami kombinálható az így létrejövő változatok szelekciójával. A vizsgált fehérje génjének a természetben előforduló vagy például hibára hajlamos PCR segítségével előállított különböző változatait DN-áz I enzim segítségével véletlenszerűen fragmentumokra hasítják, majd az így kapott DNS töredékeket tartalmazó mintán hozzáadott primerek nélkül PCR-t végeznek. A PCR során a gén különböző változataiból származó töredékek a komplementer szekvenciájú szakaszoknál párosodhatnak egymással, így kvázi primerként szolgálva a másoláshoz. Az eredetivel megegyező hosszúságú szekvenciák épülnek fel a PCR reakció során, amelyek több kiindulási szekvenciára jellemző szakaszból állnak. Az újra felépült szekvenciák a változatok olyan kombinációit hordozzák, melyek a szülői szekvenciák között nem fordultak elő, azaz a változatok között rekombináció következik be. A rekombinációnak köszönhetően a módszer alkalmas a kezdeti variáció kombinatorikus keverésére, segítségével kombinatorikus könyvtár állítható elő. A rekombináció előnye tehát a többi mutagenezis technikával szemben, hogy több cikluson keresztül zajló molekuláris evolúcióra ad lehetőséget.

16.3. ábra: „Szexuális” PCR

A módszer másik nagy előnye a rugalmasságában rejlik, ugyanis a körülmények beállításával a véletlenszerűen jelentkező pontmutációk gyakorisága a variáció további növelése érdekében változtatható. A szülői szekvenciák hozzáadásával mintegy visszakeresztezést (back cross) is el lehet végezni, amivel a káros, illetve az esetleges csendes, a funkciót nem befolyásoló mutációk mennyisége alacsonyan tartható. A szexuális PCR alkalmazható például enzimek fejlesztésére is egy olyan eljárásban, ami hasonlít az ellenanyagok képződésére a szervezetben. A kutatók négy különböző b-laktamáz enzim génjét keverték össze, majd több cikluson keresztül engedtek további rekombinációt és pontmutációt. A ciklusok között a könyvtárat hordozó sejteket moxolaktám rezisztenciára szelektálták. A leghatékonyabb előállított kiméra enzim mind a 4 kiindulási fehérjétől legalább 100 aminosav pozícióban különbözött, és számos újonnan megjelent pontmutációt is tartalmazott.

16.2.2. Helyspecifikus mutagenezisen alapuló eljárások

A DNS szintetizálás módszereinek fejlődése lehetővé teszi degenerált oligonukleotidok szintézisét, melyek segítségével - oligonukleotiddal irányított helyspecifikus mutagenezis technikákkal - kombinatorikus könyvtárak állíthatók elő. A degenerált oligonukleotidok úgy készülnek, hogy a szintézis során a meghatározott pozícióknál a reakcióhoz többféle nukleotidot adagolnak. A többféle nukleotid véletlenszerűen beépül az oligonukleotidokba. Így az oligonukleotidoknak egy olyan keveréke keletkezik, melyek az összes lehetséges kombinációban tartalmazzák a tervezett mutációkat (ld. 16.4. ábra). A degenerált oligonukleotidokkal végzett helyspecifikus mutagenezis segítségével kombinatorikus, azaz a tervezett mutációkat az oligonukleotidokhoz hasonlóan minden lehetséges kombinációban tartalmazó fehérjekönyvtár állítható elő. Az egyes mutációk gyakorisága a degenerált oligonukleotid szintézise során a különböző nukleotidok adagolásakor, azok arányának helyes megválasztásával állítható be. A helyspecifikus mutagenezis technikákon alapuló könyvtárkészítési eljárások előnye, hogy a mutációk pozíciója és az egyes pozíciókban létrejövő változatosság pontosan tervezhető.

16.4. ábra: Degenerált oligonukleotid szintézis

16.1. táblázat: IUB nukleotid szimbólumok

16.2.2.1. Telítési mutagenezis

Telítési mutagenezis során a vizsgált pozíciókban mind a 20 aminosav előfordulása megengedett. Ilyen könyvtárak esetében a randomizálandó pozíciókban a degenerált oligonukleotidok általában NNK vagy NNS kodonokat tartalmaznak, ahol N a négyféle bázist jelenti, K = G/T és S = G/C (ld. 16.4. ábra és 16.2. táblázat). Az NNK és NNS kodonok 32 kodon keverékét eredményezik. A 32 lehetséges kodon kódolja mind a 20 aminosavat, és mindössze egyféle stop kodon megjelenését teszi lehetővé. Ezzel elérhető, hogy a könyvtárban az egyes aminosavak kiindulási aránya egyenletesebb legyen, mint NNN kodonok alkalmazása esetén, valamint a stop kodon előfordulási gyakorisága is kisebb.

Telítési mutagenezissel egyszerre kevés pozíció vizsgálható, mert a könyvtár elméleti mérete, azaz a lehetséges változatok száma 6-7 pozíció vizsgálata esetén eléri a leggyakrabban alkalmazott szelekciós technikák által vizsgálható maximális méretet. Az ezzel a módszerrel készített könyvtárak legfontosabb alkalmazási területei általában lokalizált régiók feltárását célozzák meg. Ilyen feladatok pl. lineáris peptid motívumot felismerő fehérjék preferenciáinak feltárására random peptid könyvtárak alkalmazásával, vagy az ellenanyag variábilis hurok régiók vizsgálata. A telítési mutagenezis a legjobb választás akkor is, ha rövid összefüggő szakasz irányított evolúciós vizsgálatát célozzuk meg.

16.2.2.2. Mutációkkal tűzdelt (spiked) oligonukleotidok használata

Az egy könyvtárban vizsgált pozíciók számának kiterjesztésére alkalmas módszer a mutációkkal tűzdelt (spiked) oligonukleotidok használata. Ilyen könyvtárak esetén a degenerált oligonukleotid sereg tagjai alapvetően az összes pozícióban a vad típusnak megfelelő nukleotidot tartalmazzák. A szintézis során célzottan, a megváltoztatni kívánt pozíciókban adnak a vad típusú mellett kis mennyiségben más nukleotidot vagy nukleotidokat is. A mutagenezis során létrejövő könyvtár a legtöbb pozícióban vad típusú géneket fog tartalmazni, amelyek a vad típusútól eltérő nukleotidok adagolásának függvényében fognak mutációkat hordozni. Ezt a módszert használják például, ha egy kölcsönhatás paraméterein szeretnének javítani.

16.2.2.3. Megszabott kodonokat hordozó (tailored) oligonukleotidok használata

Ez a stratégia úgy terjeszti ki a vizsgálatba bevonható pozíciók számát, hogy az egyes pozíciókban csak a lehetséges 20 aminosav egy részének megjelenését engedi meg (ld. 16.2. táblázat).

16.2. táblázat: Gyakran használt aminosav készletek kódolása degenerált kodonokkal az IUB nevezéktan szerint

Ahhoz, hogy ezt a stratégiát eredményesen lehessen alkalmazni, szükségesek előzetes ismeretek a vizsgált interakcióról. Ezek alapján lehet kiválasztani, hogy az egyes pozíciókban milyen aminosavak fordulhassanak elő. A tervezésben segíthet, ha több homológ fehérje szekvenciája ismert, ha már vannak előzetes irányított evolúciós eredmények, azaz lehet tudni, hogy milyen karakterű aminosavak képesek ellátni az interakció által megkövetelt funkciót, vagy rendelkezésre áll a vizsgált molekula háromdimenziós szerkezete.