16.3. Szelekciós eljárások

16.3.1. In vitro szelekciós módszerek

In vitro könyvtárkészítési és szelekciós módszerek alkalmazásával van lehetőség a legnagyobb, akár 1013 különböző változatot tartalmazó könyvtárak előállítására. Ennek az oka az, hogy a folyamat során a DNS könyvtárat in vitro transzlációs technikákkal fejezik ki fehérje formában. Ennek köszönhetően nem kell alacsony hatékonyságú módszerekkel a DNS-t sejtekbe juttatni, így a diverzitást csak az in vitro transzláció során a rendszerben jelen lévő riboszómák és információhordozó molekulák mennyisége korlátozza.

16.3.1.1. Riboszóma-bemutatás

A riboszóma bemutatással szelektálható könyvtárat alkotó gének egy T7 transzkripciós promóterből, egy riboszóma-kötőhelyből, a könyvtárfehérje génjéből és egy polipeptid linkert kódoló szakaszból állnak (ld. 16.5. ábra). A gén nem tartalmaz stop kodont. A transzkripciót in vitro végzik T7 RNS-polimeráz segítségével, riboszómák és aminoacil-tRNS-ek, GTP valamint a szükséges iniciációs és elongációs faktorok jelenlétében. A könyvtárfehérje és az azt követő linker átíródik, a riboszóma az mRNS végére ér, de a stop kodon hiánya miatt a disszociáció nem következik be. Az átíródott peptid linkernek köszönhetően a könyvtárfehérje el tud távolodni annyira a riboszómától, hogy a feltekeredése zavartalanul végbemehessen és a szelekció során a kötőpartner hozzáférjen.

A reakció során keletkező, a riboszómából, az mRNS-ből és a könyvtárfehérjéből álló hármas komplex 4°C-on stabil. Az így létrehozott fehérje könyvtárból a vizsgált fehérje kötőpartnerével kiválaszthatóak azok a klónok, amelyek a mutációk ellenére megőrizték a partner kötésének képességét, vagy a mutációk következtében a vadtípusnál erősebben kötik azt. A szelekciós követelményeket teljesítő fehérjéket kódoló mRNS-eket reverz transzkripció után fel lehet szaporítani, ezáltal lehetőség nyílik egyrészt ismételt szelekcióra, másrészt a gének szekvenálására is.

16.5. ábra: Riboszóma bemutatás

16.3.1.2. mRNS-bemutatás

Az mRNS-bemutatás a riboszóma-bemutatás továbbfejlesztett változata. A fehérjét kódoló mRNS 3’ végéhez puromicin molekulát kapcsolnak kovalensen, egy rövid DNS linkeren keresztül. Az in vitro transzláció során a riboszóma megáll az RNS-DNS határon. Ekkor a puromicin belép a riboszóma peptidil-transzferáz helyére, és stabil amid kötést alakít ki a keletkező fehérje C-terminálisával. A keletkező komplex stabil, a kifejezett könyvtár a riboszóma-bemutatáshoz hasonlóan szelektálható.

16.3.2. A fág-bemutatás

A fág-bemutatás az irányított evolúciós módszerek legkorábban kifejlesztett képviselője. Egyszerűségének, rugalmasságának és hatékonyságának köszönhetően mindmáig a fág-bemutatás a leggyakrabban alkalmazott irányított evolúciós eljárás (ld. 16.6. ábra).

16.6. ábra: A fág bemutatás alapvonásai

A fág-bemutatás során az evolválni kívánt fehérje génjét egy bakteriofág egyik burokfehérjéje génjéhez illesztik. A gén terméke fúziós fehérje, ami a burokfehérjéből és a könyvtárfehérjéből áll, melyeket általában flexibilis peptid linker köt össze. A fúziós fehérje beépül a bakteriofág burkába, így a vizsgált fehérje megjelenik a fág felszínén. A keletkező fágok a kötőpartner számára hozzáférhető formában fejezik ki a vizsgált fehérje egy variánsát, és hordozzák annak génjét, azaz megvalósul a funkcióért felelős fenotípus és az azt kódoló genotípus fizikai kapcsolata. A könyvtárat általában helyspecifikus mutagenezisen alapuló eljárással hozzák létre, de van lehetőség pl. szexuális PCR alkalmazására is. A bakteriofág felszínén kifejezett könyvtárból kiválaszthatók a szelektív kötés képességével rendelkező változatok például szilárd felszínhez kötött specifikus kötőpartner segítségével. A kiválasztás folyamata tulajdonképpen affinitás kromatográfiás eljárással történik.

Első bemutatása óta a fág-bemutatás a nagyszámú egyedi változatot tartalmazó kombinatorikus peptid ill. fehérje könyvtárak szelekciójának leghatékonyabb módszerévé vált. Leggyakrabban a biológiailag jól feltérképezett, nem-litikus fonalas M13 fág felszínén fejezik ki a könyvtárat, de litikus fágokon (l, T4, T7) megjelenített könyvtárak is használatosak.

T7-bemutatás esetén lírikus, kétszálú DNS-t hordozó, E. coli-t fertőző T7 vírus felszínén jelenítik meg a fúziós fehérjéket. A DNS az ikozaéder formájú fejbe pakolódik. A fejet a 10-es gén két, eltérő méretű terméke alkotja hatszögű és ötszögű lapokba rendeződve. A kis peptideket tartalmazó könyvtárakat a nagyobb burokfehérje C-terminálisához kapcsolva fejezik ki nagy kópiaszámban. Nagyobb fehérjék kifejezésére csak kisebb kópiaszámban van lehetőség. A lírikus fág használatának egyik hátránya az, hogy a fágok elszaporodása során egy sejtet több fág is megfertőzhet, így létrejöhet olyan vírus is, ami több könyvtártagot is kifejez, de közülük csak az egyik génjét hordozza.

Az M13 fág használatán alapuló könyvtárak elterjedtebbek az egyszerűbb kezelhetőség, valamint a genotípus és a fenotípus közti fizikai kapcsolat könnyű biztosíthatósága miatt. A fonalas fágok kb. 10 gént tartalmazó vírusok, amelyek Gram-negatív baktériumokat fertőznek. A virion egy 6,5 nm átmérőjű, 800-2000 nm hosszú flexibilis pálca, melynek hossza a virionba pakolt DNS mennyiségétől, méretétől függ. A virion 5-féle fehérjéből áll. A fő burokfehérje (protein 8, P8) több ezer példánya alkotja a fág burkát. A virion lezárásáért a sejtből elsőként távozó végén két burokfehérje (P7, P9) öt-öt példánya, míg a másik végén két másik burokfehérje (P3, P6) szintén öt-öt példánya felel. A burok belsejében található a fág genomja, egy, a törzstől függően 5-8000 bázis méretű, cirkuláris, egyszálú DNS (ssDNS) molekula. Az M13 bakteriofág F-faktort hordozó, azaz konjugatív F-pilussal rendelkező E. coli sejteket fertőz. A fertőzés során a vírus ssDNS-e bejut a baktérium sejtbe és a sejt különböző fehérjéi és enzimei által kétszálú, replikatív dsDNS-sé alakul. A kétszálú formáról átíródnak a vírus fehérjéi. Ha a virális fehérjék koncentrációja meghalad egy küszöböt, akkor kezdetét veszi a vírus genom ún. gördülő kör (rolling-circle) mechanizmus szerint történő replikációja, amelynek során a genom virionba pakolódó szála sokszorozódik meg. A virion összeszerelődéséhez szükséges fehérjék a baktérium sejt belső membránjába kerülnek, és integráns membránfehérjeként játszanak szerepet az összeszerelődésben.

Az M13 bakteriofág felszínén megjelenített könyvtárak általában a P3, a P6 vagy a P8 fehérjéhez kapcsoltan fejezik ki a könyvtárfehérjét. A fág-bemutatás során alkalmazható vektorok típusokba oszthatók, az alapján, hogy a fúzióban érintett burokfehérje génjét milyen formában és hány kópiában hordozzák.

Az „n” (itt az n az érintett burokfehérje gén száma) típusú fág-genom vektorok a fág összes génjének, így a könyvtárfehérjét bemutató fehérje génjének (n) is egyetlen kópiáját hordozzák. A könyvtárfehérjét kódoló szekvenciát az n génhez illesztik. Az ilyen vektorról termelődő fágok virionja az n gén termékének kizárólag fúziós példányát tartalmazza. A „3”-típusú vektorral létrehozott fág csak fúziós P3-at kódol és virionja elvileg csak fúziós P3-at tartalmaz, de bakteriális enzimek a könyvtárfehérjét lehasíthatják. A „8”-típusú vektor a fő burokfehérje minden példányán hordozza a könyvtárfehérjét, ami ebben az esetben nem fehérje, hanem legfeljebb 8-10 aminosavból álló peptid, ugyanis hosszabb peptid kifejezése a virion összeszerelődését akadályozná. A könyvtárfehérjék több, „8”-as típus esetében több ezer példányban fejeződnek ki. Ez jelentős aviditást okoz: az egy fágon bemutatott fehérje több példánya egyszerre kapcsolódhat egy-egy kötőpartner molekulához, így a fág látszólagos affinitása a kötőpartnerhez az önálló könyvtártag affinitásának sokszorosa is lehet. Az „n” típusú könyvtárak esetében nem szabályozható a bemutatás valenciája, azaz az, hogy a fág hány példányban mutatja be a fúziós peptidet (ld. 16.7. ábra).

Az „nn”-típusú fág-genom vektorok az egyik burokfehérje génjének két példányát tartalmazzák, egy vad típusút és egy fúziósat. Az ilyen vektorról termelődő fágok mozaikosak, az egyik burokfehérjéből fúziósat és vad típusút is tartalmaznak. A fúziós gén elé szabályozható promótert helyezve lehetőség van a fúziós/vadtípus arányt, azaz a bemutatás valenciáját szabályozni. Az ilyen vektorok alkalmasak nagyobb peptidek vagy akár egész fehérjék kifejezésére is. Végül az „n+n”-típusú vektorok fágmid konstrukciók használatán alapulnak.

A fág-bemutatás fontos eleme az, hogy a kötőpartnerhez kapcsolódni képes variánsok képesek baktériumokban szaporodni. Ennek köszönhetően rövid idő alatt több szelekciós kör alkalmazható, melyek végére a szelektált könyvtár feldúsul a funkcionálisan hatékony klónokban. A fág-bemutatás nagy sikerrel alkalmazható kötőfelszínek energetikai viszonyainak felderítését és biológiai folyamatokban fontos szerepet játszó kötőfelszínek kismolekulájú, specifikus ligandumai fejlesztését célzó kutatásokban.

16.7. ábra: A fág-bemutatáshoz használható vektor rendszerek

16.3.3. Rekombináns fehérje könyvtár bemutatása és szelekciója élő sejtek felszínén

A fág-bemutatás egyik gyakran alkalmazott alternatívája a sejt felszínén való bemutatás. Ezekkel a technológiákkal a rekombináns fehérje könyvtár egyes tagjait élő sejtek felszínén jelenítik meg. A könyvtárat bemutató sejtek közül kiválasztják a partnerhez kötődő variánsokat bemutató sejteket, ezeket a többitől elválasztják, majd az általuk hordozott géneket elemzik. Bizonyos fehérjéket nem lehet más irányított evolúciós eljárásokkal vizsgálni vagy fejleszteni, ezért különösen fontos, hogy ma már lehetőség van sejtfelszínen történő bemutatást alkalmazni. Az évek során a kutatók kifejlesztettek bakteriális, és élesztő alapú rendszereket is.

16.3.3.1. Fehérjék irányított evolúciója baktérium sejtek felszínén

A baktérium sejtek felszínén történő irányított evolúciót lehetővé tevő rendszerek a legtöbb ponton hasonlítanak a fág-bemutatás rendszerekre. A sejtek egyetlen könyvtártag génjét tartalmazzák, ezáltal csak ez a fehérje jelenik meg a felszínükön, azaz megvalósul a genotípus és a fenotípus klonális fizikai kapcsolata. Fontos eltérés viszont, hogy a rendszerben lévő részecskék, azaz maguk a sejtek sokkal nagyobbak a fágoknál, valamint a bemutatott fehérje minden esetben sok példányban megjelenik a sejt felszínén. Eltérés az eddig bemutatott rendszerektől az is, hogy a rekombináns fehérje könyvtárat megjelenítő sejtek szelekcióját általában nem affinitás kromatográfiás módszerrel, hanem fluoreszcenciával aktivált sejtszortírozó berendezés (FACS) segítségével végzik el.

A könyvtárból való szelekciónak legegyszerűbb módja a fluoreszcensen jelölt partnerrel való inkubálás oldat fázisban, majd a jelölt sejtek elválasztása a jelöletlenektől FACS rendszerben. A könyvtártagokat bemutató sejteket a könyvtárban vizsgált fehérje fluoreszcensen jelölt kötőpartnerével inkubálják oldat fázisban. A partnert kötni képes változatokat bemutató sejtek így fluoreszcensen jelöltté válnak. A multivalens bemutatásnak köszönhetően a funkcióképes változatokat bemutató sejtek elegendő fluoreszcensen jelölt partner molekulát kötnek meg ahhoz, hogy a FACS berendezés segítségével el lehessen választani a jelölt és a jelöletlen sejteket egymástól. A FACS készüléken be lehet állítani, hogy milyen intenzitású fluoreszcens jelet adó sejteket gyűjtsön külön a többitől. A sejtek által megkötött jelölt fehérjék mennyisége, azaz a jel intenzitása arányos a bemutatott változat affinitásával, azaz az ún. küszöbérték helyes megválasztásával kiválaszthatóak a könyvtárból a legnagyobb affinitású változatok.

Ezzel a módszerrel lehetőség van bizonyos antigénekre specifikus ellenanyagok fejlesztésére is. Erre a fág-bemutatás is alkalmas, viszont a sejt felszínén való bemutatás és FACS rendszerrel történő szelekciónak új lehetőségeket is biztosít. Az ellenanyagok fontos tulajdonsága a kereszt-reaktivitás, azaz az, hogy a célponthoz hasonló antigéneket felismer-e az ellenanyag. A sejt felszínén történő bemutatással megoldható akár kereszt-reaktív, akár nagyon specifikus ellenanyagok kifejlesztése. Ilyen esetekben a szelekció során többféle antigént alkalmaznak, amelyeket különböző jelöléssel látnak el. Ha kereszt-reaktív ellenanyag kifejlesztése a cél, akkor a FACS készüléket úgy programozzák, hogy azokat a sejteket gyűjtse külön, amelyek többféle fluoreszcens jelölést is hordoznak. Ha specifikus ellenanyagot keresnek a könyvtárban, akkor a sejtek válogatása során kizárják a gyűjtött mintából a többféle fluorofórral jelölt sejteket.

Az elmúlt években sikeres irányított evolúciós vizsgálatokat végeztek különböző ellenanyag fragmentumok, teljes ellenanyagok, rövid peptidek és más globuláris fehérjék baktérium sejtek felszínén bemutatott és szelektált könyvtárakkal.

16.3.3.2. Fehérjék irányított evolúciója élesztő sejtek felszínén

A rekombináns fehérje könyvtárak élesztő sejtek felszínén való megjelenítése és szelekciója dinamikusan fejlődő terület. Az élesztő felszíni bemutatás egyedülálló lehetőséget kínál számos olyan fehérje vizsgálatára, amelyeket más irányított evolúciós rendszerben nem lehet kifejezni. Az élesztő felszíni bemutatás rendszerekben olyan fúziós gént hoznak létre, amelyről a könyvtár fehérje az élesztő sejtfalába ágyazott fehérjék egyikével összekapcsoltan termelődik, és ezáltal megjelenik az élesztő sejt felszínén. Ezekben a rendszerekben a könyvtárfehérjét glikozil-foszfatidil-inozitol (GPI) horgonnyal ellátott fehérjékkel, vagy azok megfelelő részletével fúzióban állítják elő. Ezek a fehérjék a sejten kívül a sejtfal komponenseivel vagy más membránfehérjékkel kovalens kötéssel is kapcsolódnak.

Lehetőség van a könyvtárfehérje nem-kovalens bemutatására is. Ilyen rendszerekben a fúziós partner olyan élesztő fehérje, ami a sejtből kijutva a sejtfal mannán láncaihoz kötődik másodlagos kölcsönhatásokon keresztül. Eukarióta transzmembrán fehérjék horgonyként szolgáló fúziós partner alkalmazása nélkül is kifejezhetőek élesztő felszínén.

Az élesztő felszínén megjelenített könyvtárak szelekciója a baktérium sejt felszínen kifejezett könyvtárakhoz hasonlóan történhet szilárd felszínhez rögzített partner molekulákhoz való kötődés alapján, vagy fluoreszcensen jelölt partner és FACS alkalmazásával.

Az élesztő felszíni bemutatást leggyakrabban más molekulákhoz kötni képes fehérjék kötőfelszínének feltérképezésére, vagy a vad típusú molekulánál nagyobb affinitású, esetleg megváltozott specifitású változatok kifejlesztésére használják. Ezzel a módszerrel számos specifikus és nagy affinitású ellenanyagot sikerül kifejleszteni különböző antigénekkel szemben.