17. fejezet - Kölcsönhatások kimutatása géntechnológiai módszerekkel

Tartalom

17.1. Az élesztő két-hibrid rendszer bemutatása
17.2. Az élesztő két-hibrid rendszer gyengeségei
17.3. Hasonló alapokon működő technikák
17.3.1. Fordított két-hibrid rendszerek
17.3.2. Egy-hibrid rendszerek
17.3.3. Három-hibrid rendszerek
17.4. További olvasnivaló a fejezethez

A fehérjék kölcsönhatásainak kimutatása az 1990-es évek elejéig gyakran nehezen leküzdhető akadályokat gördített a kutatók útjába. A géntechnológia eszköztárának fejlődése és a biológiai folyamatok molekuláris szinten való egyre részletesebb megismerése együtt tette lehetővé a kölcsönhatások kimutatására szolgáló technikák kifejlesztését az 1980-as évek második felétől. A fehérjék más fehérjékkel, DNS-sel vagy kis molekulákkal az élő sejtben kialakított kölcsönhatásainak kimutatására alkalmas in vivo módszerekre nagy igény mutatkozott az alap- és az alkalmazott kutatásban egyaránt. Az élesztő két-hibrid (yeast two-hybrid) eljárás volt az egyik első, erre alkalmas eljárás.

17.1. Az élesztő két-hibrid rendszer bemutatása

Az élesztő két-hibrid rendszer és annak különböző változatai a fehérjék más molekulákkal kialakított interakcióinak kimutatására szolgáló, teljes egészében in vivo rendszerek. A módszercsalád különböző változatainak alkalmazásával lehetőség van fehérje-fehérje, fehérje-DNS, fehérje-kismolekula kölcsönhatások kimutatására. A módszerek alkalmasak az irányított evolúciós technikáknál alkalmazott könyvtárakból történő szelekcióra is. Ezekben az esetekben egy fehérje rengeteg változata közül választják ki azokat, amelyek képesek kötni a vizsgálatban alkalmazott partnerhez. Az élesztő két-hibrid módszert azonban gyakrabban alkalmazzák arra is, hogy nagyszámú különböző fehérjét tartalmazó könyvtárból kimutassák azokat a fehérjéket, amelyek kötnek az alkalmazott partnerhez vagy partnerekhez. A fentiek értelmében az élesztő két-hibrid rendszer alkalmazása során nem egyetlen interakció részletes feltérképezését végzik el, hanem a sejten belül létrejövő, fiziológiás vagy patológiás folyamatokban releváns kölcsönhatásokat keresnek.

Az elsőként leírt élesztő két-hibrid technika elnevezése arra utal, hogy ebben a rendszerben kétféle hibrid, azaz fúziós fehérjét alkalmaznak a kölcsönhatás kimutatására. Az eljárás azon alapul, hogy a génátírást serkentő transzkripciós faktorok moduláris felépítésű, több doménből álló fehérjék. Bizonyos domének felelősek a megfelelő DNS szakaszok (upstream szabályozó elemek) specifikus megkötéséért (DKD:DNS-kötő domén). Más domének a transzkripció iniciációjáért felelős fehérjékkel alakítanak ki kölcsönhatást és a kölcsönhatásokon keresztül serkentik a gén transzkripcióját (transzkripciót aktiváló domén, TAD). A génátírás serkentéséhez a két doménnek egy időben kell jelen lennie a gén promóterénél, de nem feltétlenül kell egyetlen polipeptidláncon belül, kovalensen összekötve lenniük, a kölcsönhatásuk lehet közvetett. A két önálló fehérjeként előállított DKD és TAD domének nem ismerik fel egymást, nem lépnek egymással kölcsönhatásba. Azonban ha az egyiket egy „A” fehérjéhez, a másikat pedig egy „B” fehérjéhez fuzionáljuk, akkor amennyiben az „A” és „B” fehérjék egymást felismerik, úgy a kötődésük miatt megvalósul a DKD és TAD domének térbeni közelsége. A DKD révén a komplex a megfelelő helyen lokalizálódik és a TAD képes serkenteni azoknak a géneknek a kifejeződését, amelyek szabályozó régiója tartalmazza az alkalmazott DKD által felismert szekvenciát. Az élesztő két-hibrid rendszerekben az „A és”B” fehérjék kölcsönhatása egy riporter gén átíródását eredményezi. A riporter gén kifejeződése alapján választják ki azokat a klónokat, amelyekben kialakult az „A” és „B” fehérje közti kapcsolat.

Az eredeti élesztő két-hibrid rendszerben a S. cerevisiaeGal4 transzkripciós faktor DKD és TAD doménjét használták. A Gal4 transzkripciós faktor szükséges a LacZ riporter gén aktiválásához. A LacZ gén terméke, a β-galaktozidáz enzim. Azok a sejtek kék színűek lesznek X-Gal kromogén szubsztrát analógot tartalmazó közegben, amelyekben a riporter gén kifejeződik. A vizsgálatok során olyan élesztő törzseket alkalmaznak, amelyekben nem termelődik a riporter gén terméke. Ennek köszönhetően a riporter fehérje csak akkor jelenhet meg, ha az „A” és „B” fehérje kölcsönhatásba lép egymással (ld. 17.1. ábra)

17.1. ábra: Az élesztő két-hibrid rendszer sémája

Az élesztő két-hibrid rendszerben a DKD doménhez fúzionálják az úgynevezett csali fehérjét (bait). Egy vizsgálatban egyféle csali fehérjét alkalmaznak, a vizsgálat célja a csali fehérje kötőpartnereinek azonosítása. A TAD doménhez fuzionálják az úgynevezett préda fehérjét (pray) vagy fehérjéket. A préda lehet egyetlen fehérje könyvtára, de gyakrabban alkalmaznak sok ismert vagy ismeretlen fehérjét tartalmazó cDNS könyvtárakat. A kétféle plazmiddal ezután élesztő sejteket transzformálnak, majd kiválasztják a rendszerből azokat a sejteket, amelyekben kifejeződött a riporter gén a csali és a préda fehérje kölcsönhatásának következtében. A sejtek szelekciójára többféle lehetőség van. A fent bemutatott LacZ riporter gén használata során azok a sejtek kék színűek lesznek X-Gal jelenlétében, amelyekben a riporter gén kifejeződik. Ebben az esetben azok a sejtek is életképesek, amelyekben nincs kölcsönhatás a csali és a préda fehérje között. A szelekciós eljárások másik típusa során a 13.1.2. fejezetben bemutatott auxotróf törzset használnak, a riporter gén pedig az, amelynek mutációja a törzset auxotróffá teszi. HIS3 szelekciós marker esetén az egyik plazmid tartalmazza a hisztidin bioszintézishez szükséges, az alkalmazott törzsben hibás enzim génjének jó kópiáját. A gén olyan promóterrel van ellátva, amiről csak akkor íródhat át a fehérje, ha a csali-préda interakció biztosítja a TAD jelenlétét a promóteren szerveződő fehérje komplexben. A csali plazmidot és a préda-könyvtár egy tagját tartalmazó sejteket ezután hisztidin mentes tápközegben növesztik. Csak azok a sejtek élnek túl és képesek növekedni, amelyekben a csali és a préda kölcsönhatásba lép egymással és átíródik a hisztdin bioszintézishez nélkülözhetetlen fehérje.