17.3. Hasonló alapokon működő technikák

Az élesztő két-hibrid rendszerhez hasonló technikák sorát fejlesztették ki az elmúlt két évtizedben. Ezek egyrészt olyan kölcsönhatások vizsgálatára alkalmasak, amelyekre az eredeti rendszer alkalmazásával nincs lehetőség, másrészt az eredeti rendszer hiányosságainak kiküszöbölésére kínálnak megoldást. A következőkben bemutatott technikák az irányított evolúciós rendszerekhez hasonlóan egy adott kölcsönhatás feltérképezésére, vagy új kölcsönható molekulák kifejlesztésére alkalmazhatóak.

17.3.1. Fordított két-hibrid rendszerek

A fordított (reverz) két-hibrid rendszerek alkalmasak egy adott kölcsönhatás kialakulása szempontjából kritikus aminosavak feltérképezésére. Ezek a rendszerek olyan riporter géneket alkalmaznak, amelyek terméke a sejt számára toxikus. Ennek következtében azok a sejtek maradnak életben, amelyekben a csali és a préda interakciója a csali fehérje mutációja következtében nem jön létre. A túlélő sejtek által kifejezett csali fehérjék génjeinek vizsgálatával megállapítható, hogy milyen mutáció vagy mutációk voltak felelősek a két fehérje közti kölcsönhatás kialakulásának megakadályozásáért (ld. 17.2. ábra).

17.2. ábra: Reverz élesztő két-hibrid rendszer

17.3.2. Egy-hibrid rendszerek

Az egy-hibrid rendszerekben egyetlen fúziós fehérjét alkalmaznak. A leggyakrabban adott DNS szekvenciát felismerő DKD kifejlesztésére, vagy adott DKD által felismert DNS szekvencia megkeresésére használják. Előbbi esetben a riporter fehérje génjének szabályozó régiójába építik az adott DNS szekvenciát. A kísérlet során alkalmazott fúziós fehérje egy DKD-hez fúzionált TAD konstrukció. A DKD DNS kötésért felelős aminosav pozícióit randomizálják, így DKD könyvtárat hoznak létre. A szelekció során azokban a sejtekben fejeződik ki a riporter fehérje, amelyekben a DKD variáns felismeri a riporter gén szabályozó régiójába épített DNS szekvenciát. Az utóbbi esetben a riporter gén szabályozó régiójába nem egy konkrét DNS szekvenciát építenek be, hanem DNS könyvtárat hoznak létre. A könyvtárból aztán egy DKD-TAD fúziós fehérjével kiválasztják azokat a változatokat, amelyekhez a DKD kötni képes (ld. 17.3. ábra).

Az élesztő egy-hibrid rendszer

17.3. ábra: Az élesztő egy-hibrid rendszer. Az élesztő egy-hibrid rendszer alkalmazható egy adott DKD által felismert DNS szekvencia megkeresésére vagy adott DNS szekvenciát felismerő DKD kifejlesztésére.

17.3.3. Három-hibrid rendszerek

A három-hibrid rendszerek három fúziós fehérje vagy hibrid molekula alkalmazásával mutatják ki a keresett interakciót. Különböző változatai alkalmasak fehérje-RNS és fehérje-kismolekulakölcsönhatások, valamint enzimatikus aktivitás kimutatására is.

A fehérje-kismolekula interakció kimutatására szolgáló vizsgálatok során általában kismolekula könyvtárakból válogatják ki azokat a gyógyszer hatóanyag jelölt molekulákat, amelyek kötnek egy adott gyógyszer célpont fehérjéhez. Az ilyen vizsgálatok során a DKD doménhez egy olyan fehérjét fuziónálnak, amelynek ismerik erős és specifikus kismolekula partnerét. A TAD doménhez fúzionálják a gyógyszer célpont fehérjét. A vizsgálat során olyan hibrid kismolekula könyvtárat használnak, amelynek tagjai a tesztelt gyógyszer hatóanyag jelölt csoportok mellett tartalmazzák a DKD doménhez kapcsolt fehérje kismolekula ligandumát is. A kismolekula könyvtár tagjai az ismert ligandumon keresztül kapcsolódnak a DKD fúziós fehérjéhez. A vizsgálat során sejttenyésztó lemezek mintahelyein élesztő sejteket növesztenek, és minden mintahelyhez hozzáadják a hibrid kismolekula könyvtár egy tagját. Ha az adott könyvtár tag gyógyszer hatóanyag jelölt csoportja kapcsolódik a gyógyszercélpont fehérjéhez, akkor kifejeződik a riporter fehérje. A riporter gén kifejeződése alapján feltételezhetően a gyógyszer célpont fehérjéhez kötő kismolekulákat később megbízhatóbb módszerekkel is tesztelik (ld. 17.4. ábra).

17.4. ábra: Gyógyszer hatóanyag jelölt molekulák kiválasztása kismolekula könyvtárból élesztő három-hibrid módszerrel