Géntechnológia és fehérjemérnökség

Szerkesztette: Nyitray László

Alexa Anita (12. és 13. fejezet)

Fodor Krisztián (3. és 9. fejezet)

Garai Ágnes (4. és 5. fejezet)

Glatz Gábor (6. és 7. fejezet)

Radnai László (1. és 2. fejezet)

Rapali Péter (11. fejezet)

Szakács Dávid (8., 16. és 17. fejezet)

Várkuti Boglárka (15. fejezet)

Zeke András (10. és 14. fejezet)

Lektorálta 
Várallyai Éva

E könyv kutatási és oktatási célokra szabadon használható. Bármilyen formában való sokszorosítása a jogtulajdonos írásos engedélyéhez kötött.

Készült a TÁMOP-4.1.2.A/1-11/1-2011-0073 számú, „E-learning természettudományos tartalomfejlesztés az ELTE TTK-n” című projekt keretében. Konzorciumvezető: Eötvös Loránd Tudományegyetem, konzorciumi tagok: ELTE TTK Hallgatói Alapítvány, ITStudy Hungary Számítástechnikai Oktató- és Kutatóközpont Kft.


Köszönetnyilvánítás

Az elektronikus jegyzet a TÁMOP-4.1.2.A/1-11/-1-2011-0073 (E-learning természettudományos tartalomfejlesztés az ELTE TTK-n) és a TÁMOP 4.2.4.A/1-11-1-2012-0001 (Nemzeti Kiválóság Program - Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program; támogatott: Várkuti Boglárka) pályázatok támogatásával készült.

Tartalom

Előszó
1. A géntechnológia történetének mérföldkövei
1.1. Az örökítőanyag felfedezésétől a genetikai kód megfejtéséig
1.1.1. A DNS felfedezése és a kólibaktérium leírása
1.1.2. A DNS örökítőanyag szerepének tisztázása
1.1.3. A DNS kettőshélix felfedezése, a genetikai kód megfejtése
1.2. A DNS „manipulálására” alkalmas enzimek felfedezése
1.3. A rekombináns DNS technika megjelenése
1.4. Hibridizáción alapuló technikák megjelenése
1.5. A szekvenálástól a genom korszakig és tovább
1.5.1. A polimeráz láncreakció felfedezése
1.5.2. Géntechnológiai eljárások magasabbrendű szervezetekben
1.6. További olvasnivaló a fejezethez
2. A géntechnológia alapja: molekuláris klónozás
2.1. In vitro rekombináció
2.2. Rekombináns DNS létrehozása
2.3. Molekuláris klónok kialakítása
2.4. További olvasnivaló a fejezethez
3. DNS módosító enzimek és felhasználásuk
3.1. DNS-polimerázok
3.1.1. A DNS-polimeráz I és a Klenow-fragmentum
3.1.2. T4 DNS-polimeráz
3.1.3. T7 DNS-polimeráz
3.1.4. Hőstabil DNS-polimerázok
3.1.5. Reverz transzkriptáz
3.2. Nukleázok
3.2.1. Restrikciós endonukleázok
3.2.2. Egyéb nukleázok
3.3. DNS-ligázok
3.4. Végmódosító enzimek
3.4.1. Terminális transzferáz
3.4.2. Alkalikus foszfatáz
3.4.3. T4 polinukleotid-kináz
3.5. További olvasnivaló a fejezethez
4. Alapmódszerek és rekombináns DNS konstrukciók tervezése
4.1. Alapmódszerek
4.1.1. A DNS tisztítása és analízise
4.1.2. Gélelektroforézis
4.1.3. Hibridizációs technikák és nukleinsav próbák
4.2. Rekombináns konstrukciók tervezése
4.2.1. Az inszert előállítása
4.2.2. A vektor előkészítése
4.2.3. Ligálás
4.2.4. TA/Topo-klónozás
4.2.5. Ligálás-független klónozás
4.2.6. Restrikciós hasítás nélküli ligálás rekombinációval (attB, attP)
4.3. Génbeviteli eljárások
4.3.1. Transzformálás
4.3.2. Transzfektálás
4.3.3. Elektroporáció
4.3.4. Infekció
4.3.5. Génpuska
4.4. További olvasnivaló a fejezethez
5. DNS szekvenálás
5.1. Kémiai szekvenálás: radioaktív végjelölt templát
5.2. Enzimatikus szekvenálás: láncterminációs módszer
5.2.1. Manuális láncterminációs szekvenálás
5.2.2. Automata fluoreszcens szekvenálás
5.3. Új-generációs szekvenálás
5.3.1. Piroszekvenálás
5.3.2. Illumina/Solexa szekvenálás
5.3.3. SOLiD (Sequencing by Oligonucleotid Ligation and Detection)
5.3.4. TSMS (True Single Molecule Sequencing: Valódi egymolekulás szekvenálás)
5.3.5. SMRT (Single Molecule Real-time: Egymolekulás valósidejű) szekvenálás
5.4. További olvasnivaló a fejezethez
6. Polimeráz láncreakció (PCR)
6.1. A PCR lépései
6.1.1. Denaturálás
6.1.2. Anellálás
6.1.3. Polimerizáció/lánchosszabbítás (extenzió)
6.2. A PCR reakció komponensei
6.2.1. PCR templát
6.2.2. PCR enzimek
6.2.3. PCR primerek
6.2.4. Egyéb PCR komponensek
6.3. A PCR termék (amplikon) detektálása és kvantitatív PCR
6.3.1. Agaróz és poliakrilamid gélelektroforézis
6.3.2. Valós idejű (real-time) vagy kvantitatív (q-) PCR
6.4. A PCR az alapkutatásban
6.4.1. A PCR termék (amplikon) klónozása és klónozás PCR-rel
6.4.2. Szekvenálás PCR készülékben
6.4.3. Mutagenezis
6.4.4. Reverz transzkripciós (RT-) PCR
6.4.5. További PCR módszerek (random, fúziós, multiplex, fészkes és inverz)
6.5. PCR az alkalmazott kutatásban
6.5.1. Orvosi diagnosztika
6.5.2. Igazságügyi orvostan (DNS „ujjlenyomat”)
6.5.3. „Ős”-PCR
6.6. További olvasnivaló a fejezethez
7. Vektor-gazda rendszerek
7.1. A vektorok általános jellemzői
7.1.1. Klónozó és expressziós vektorok
7.1.2. Antibiotikum rezisztencia gének
7.2. Plazmid vektorok
7.2.1. A plazmidok általános jellemzői
7.2.2. A pBR322 vektor
7.2.3. A pUC vektorcsalád
7.2.4. Fágmidok
7.3. Bakteriofág vektorok
7.3.1. λ-fág vektorok
7.3.2. M13-alapú vektorok
7.4. Kozmidok
7.5. Mesterséges kromoszómák (PAC, BAC, YAC, HAC)
7.6. Élesztő és egyéb eukarióta vektorok és gazdasejtek
7.7. További olvasnivaló a fejezethez
8. Rekombináns DNS könyvtárak
8.1. A könyvtárak típusai
8.2. Genomiális DNS könyvtárak
8.2.1. A genomiális könyvtárak létrehozásáról általában
8.2.2. Könyvtár vektorok
8.2.3. λ-fág könyvtárak
8.2.4. Kozmid könyvtárak
8.2.5. Mesterséges kromoszóma könyvtárak (BAC és YAC)
8.2.6. Genomiális könyvtárak felhasználási területei
8.3. cDNS könyvtárak
8.3.1. cDNS könyvtárak létrehozása
8.3.2. cDNS könyvtárak szűrése és fenntartása
8.3.3. cDNS könyvtárak felhasználási területei
8.4. További olvasnivaló a fejezethez
9. Genom projektek
9.1. A genomszekvenálás alapjai
9.1.1. Térképezés
9.1.2. Genomszekvenálás térkép-alapú módszerrel
9.1.3. A shotgun módszer
9.2. Egy példa: a Haemophilus influenzae baktérium szekvenciájának meghatározása
9.2.1. A lefedettség (coverage) jelentősége
9.2.2. Paired-end szekvenálás
9.3. A Humán Genom Projekt (HGP)
9.3.1. Nehézségek a humán genom vizsgálatában
9.3.2. Elindul a HGP
9.3.3. Megjelenik egy versenytárs
9.3.4. A humán genom vázlatos (draft) szekvenciája
9.3.5. 2003-ra elkészül a szekvencia
9.3.6. A szekvenálás technikájának fejlődése
9.3.7. Etikai kérdések avagy kinek a DNS-ét használták a szekvenáláshoz?
9.4. További genom projektek
9.5. További olvasnivaló a fejezethez
10. Bevezetés a bioinformatikába
10.1. B ioinformatikai adatbázisok
10.1.1. Bibliográfiai gyűjtemények
10.1.2. DNS szekvencia-adatbázisok: GenBank és Ensembl
10.1.3. Fehérje-szekvencia adatbázisok: UniProt
10.1.4. Az "omikák" világa. Fajonkénti adatbankok.
10.1.5. Szerkezeti és funkcionális adatbázisok
10.2. Szekvencia-illesztések és egyéb fontos algoritmusok
10.2.1. Páronkénti szekvencia-illesztések (pairwise alignments)
10.2.2. A szekvencia-illesztés paraméterei
10.2.3. A BLAST algoritmus
10.2.4. Szekvenálás ellenőrzése illesztésekkel. Plazmid szerkesztők
10.2.5. Többszörös illesztések (multiple alignments). A Clustal programcsomag
10.2.6. Evolúciósan konzervált elemek azonosítása
10.2.7. Automatizált módszerek a szekvenciák elemzésére
10.3. Nukleinsavak tulajdonságainak jóslása
10.3.1. Leolvasási keretek és gének jóslása
10.3.2. Gén meghatározás cDNS alapján. Eukarióta gének analízise
10.3.3. DNS és RNS szerkezetek jóslása. Oligonukleotid tervezés
10.3.4. Nukleinsavak "olvadáspontja"
10.4. Fehérjék tulajdonságainak jóslása
10.4.1. A fehérjék egyszerű fizikai tulajdonságainak becslése. Reverz transzláció
10.4.2. Lineáris motívumok keresése fehérjékben (és nukleinsavakban)
10.4.3. Fehérjeszerkezetek jóslása. Rendezett és rendezetlen régiók
10.5. In silico szerkezeti analízisek
10.5.1. Makromolekulák grafikai megjelenítése
10.5.2. Homológia-modellezés és in silico dokkolás
10.6. A predikciós módszerek pontossága
10.6.1. Egy predikció "jóságát" leíró paraméterek. Optimális döntések.
10.6.2. Adatbázisok minősége: elsődleges és másodlagos hibák
10.6.3. Ellenőrzött adatbázisok. Ellentmondó kísérleti eredmények kezelése
10.6.4. Mikor használjunk jóslásokat?
10.7. További olvasnivaló a fejezethez
11. In vitro mutagenezis
11.1. Nem-irányított in vitro mutagenezis módszerek
11.1.1. Mutátor baktérium sejtvonalak
11.1.2. Hibát ejtő (error prone) PCR mutagenezis
11.2. Helyspecifikus in vitro mutagenezis módszerek
11.2.1. DNS kazetta mutagenezis
11.2.2. Szelektív templát lebontáson alapú mutagenezis módszerek
11.2.3. PCR alapú irányított mutagenezis módszerek
11.3. További olvasnivaló a fejezethez
12. In vitro és prokarióta expressziós rendszerek
12.1. In vitro expressziós rendszerek
12.1.1. Az in vitro transzlációs rendszer komponensei
12.1.2. Előnyök és hátrányok
12.1.3. Alkalmazások
12.2. Prokarióta expressziós rendszerek
12.2.1. Bakteriális promóterek és a riboszóma kötőhely
12.2.2. A prokarióta fehérje expresszió optimalizálása
12.2.3. Fúziós rekombináns konstrukciók
12.2.4. Rekombináns fehérjék termelése és izolálása
12.2.5. A prokarióta expresszió előnyei, hátrányai
12.3. További olvasnivaló a fejezethez
13. Eukarióta expressziós rendszerek
13.1. Élesztő expressziós rendszer
13.1.1. Az expressziós kazetta
13.1.2. Szelekciós markerek
13.1.3. Szekréció
13.1.4. Poszttranszlációs módosítások
13.1.5. Az expresszió lépései
13.1.6. Élesztő expressziós vektorok és rendszerek
13.1.7. Az élesztő expressziós rendszer előnyei és hátrányai
13.2. Bakulovírus expressziós rendszer
13.2.1. „Bac-to-Bac” rendszer
13.2.2. Közvetlen bakulovírus (Direkt Bac) rendszer
13.2.3. A bakulovírus rendszer előnyei és hátrányai
13.3. Emlős expressziós rendszer
13.3.1. Emlős expressziós vektorok
13.3.2. Sejtvonalak
13.3.3. Génbevitel emlős sejtbe
13.3.4. Indukálható emlős expressziós rendszerek
13.4. Egyéb eukarióta expressziós rendszer
13.4.1. Dictyostelium discoideum expressziós rendszer
13.4.2. Drosophila melanogaster expressziós rendszer
13.5. Eukarióta sejttenyésztés
13.6. További olvasnivaló a fejezethez
14. Célzott génmódosítás (gén-targeting) módszerek
14.1. Bevezetés
14.2. DNS hibajavítás és homológ rekombináció
14.3. Gén-targeting konstrukciók előállítása
14.3.1. A recombineering alapjai. A Red rekombinációs rendszer
14.3.2. Gateway klónozás
14.3.3. Targeting vektorok tervezése
14.3.4. A gén-targeting konstrukciók elkészítése
14.4. A targeting-konstrukció bejuttatása a célszervezetbe
14.4.1. Sejtek és sejtvonalak transzfektálása. Emlős embriók manipulációja
14.4.2. Stabil transzfekció. Transzgének célzás nélküli bevitele
14.4.3. Növényi és gomba sejtek transzformálása. Homológ rekombináció növényekben
14.4.4. Növények genetikai módosítása Ti plazmid segítségével
14.5. Knock-out és knock-in technikák
14.5.1. Homing endonukleázok. Cre/Lox és Flp/Frt rendszerek
14.5.2. Célszekvenciára tervezett hasító enzimek. Cink-ujjas és TALE-nukleázok
14.5.3. Génkiütési technikák (knock-out) és új gének célzott beépítése (knock-in)
14.5.4. Feltételes génkiütés, génjavítás
14.5.5. Genetikai elemek beépítése transzpozonok segítségével
14.6. Géncsendesítés (knock-down) RNS interferenciával
14.7. Stabil episzomális rendszerek
14.8. További olvasnivaló a fejezethez
15. Transzgenikus élőlények. Génterápia
15.1. A transzgenikus élőlények típusai és felhasználásuk
15.1.1. Transzgenikus mikrobák
15.1.2. Transzgenikus növények
15.1.3. Transzgenikus állatok az alapkutatásban és a gyógyászatban
15.2. Génterápia
15.3. A transzgenikus élőlények felhasználásának tudományetikai és környezetbiztonsági kérdései
15.4. További olvasnivaló a fejezethez
16. Irányított evolúciós technikák
16.1. Az irányított evolúciós megközelítésről általában
16.2. Könyvtárkészítési technikák
16.2.1. PCR alapú könyvtárkészítési eljárások
16.2.2. Helyspecifikus mutagenezisen alapuló eljárások
16.3. Szelekciós eljárások
16.3.1. In vitro szelekciós módszerek
16.3.2. A fág-bemutatás
16.3.3. Rekombináns fehérje könyvtár bemutatása és szelekciója élő sejtek felszínén
16.4. További olvasnivaló a fejezethez
17. Kölcsönhatások kimutatása géntechnológiai módszerekkel
17.1. Az élesztő két-hibrid rendszer bemutatása
17.2. Az élesztő két-hibrid rendszer gyengeségei
17.3. Hasonló alapokon működő technikák
17.3.1. Fordított két-hibrid rendszerek
17.3.2. Egy-hibrid rendszerek
17.3.3. Három-hibrid rendszerek
17.4. További olvasnivaló a fejezethez
18. Függelék