5.3. A stresszelt növények fluoreszcenciája

A különböző stresszorok hatására fellépő válaszreakciók során a növényekben jellegzetes fluoreszcencia sajátságokkal rendelkező metabolitok is felhalmozódnak. Ezek általában olyan anyagok, melyek a kék és a zöld spektrális tartományban emittálnak. A stresszorok közvetve, vagy közvetlenül a fotoszintetikus apparátus módosulását, vagy akár károsodását is okozhatják, ezért a legfontosabb fotoszintetikus pigment, a klorofill-a fluoreszcencia jellemzőit is megváltoztatják. A fluoreszcencia leképezést – elsősorban a vörös és a távoli vörös régióban – kiterjedten alkalmazzák a fotoszintetikus apparátus állapotának jellemzésére. E célra kidolgozott speciális technikákkal olyan fotoszintetikus paraméterek is közvetlenül leképezhetők, mint a PSII maximális kvantumhatékonyságát jelző Fv/Fm, vagy a különféle fotokémiai és a nem-fotokémiai kioltás paraméterek. A stresszfiziológiai vizsgálatokban azonban a fotoszintetikus működést jellemző paramétereken kívül nagyon informatív a kék és a zöld spektrális régióban emittált fluoreszcencia mértéke (5.1. ábra.) és a vörös, valamint a távoli vörös fluoreszcenciához viszonyított aránya. Ennek meghatározására, egy levél felületén történő képszerű megjelenítésére ad lehetőséget a többhullámhosszú (multispektrális) fluoreszcencia leképező rendszer.

Egyes növényi stresszorok, mint pl. a nitrogénhiány, vagy a nagy fényfelesleg a klorofill-a vörös fluoreszcenciájának csökkenése révén az F440/F690 fluoreszcencia arány növekedését okozzák. Ugyanakkor ezen és más stresszorok hatására a klorofill destrukció fokozódhat, a bioszintézis lassulhat, ami a klorofill-a fluoreszcenciájának az alacsonyabb klorofilltartalom miatti kisebb önabszorpciója révén, 690 nm-nél nagyobb intenzitású vörös fluoreszcenciát eredményez. Ezért az F690/F740 arány is nagyobb lesz, mely arány az in situ klorofilltartalom inverz indikátora. Ugyanakkor a kék és zöld fluoreszcencia intenzitása is emelkedhet, amennyiben tartós stressz esetén az UV-abszorbeáló, kék és zöld tartományban fluoreszkáló anyagok mennyisége az epidermiszben nő, ugyanakkor a kék és zöld fluoreszcenciát abszorbeáló pigmentek (klorofillok és karotinoidok) mennyisége lassan csökken. Ezáltal kevesebb UV sugárzás jut a mezofillum sejtjeibe, ami ugyancsak a vörös fluoreszcencia csökkenését eredményezi. Az F440/F690 arány is nő, de ezt sok esetben elsősorban a kék spektrális régióban emittáló stresszjelző anyagok mennyiségének növekedése okozza.

Egy fotoszintézisgátló herbiciddel, a diuronnal kezelt dohánynövényben a F440/F690 és a F690/F740 fluoreszcencia arányok csökkentek, mivel a klorofill-a fluoreszcenciája a fotoszintézis gátlása következtében megnőtt, miközben a kék fluoreszcencia intenzitása nem változott szignifikánsan. Hasonló változások voltak megfigyelhetők a hőkezelt dohánynál. Stresszorok hatására a kék fluoreszcencia intenzitása általában kisebb ingadozásokat mutat, mint a klorofill fluoreszcencia. Az F440/F690 és az F440/F740 arányok jó és korai stresszindikátorok, melyek érzékenyen reagálnak a stressz-szituációkra, a megváltozott környezeti feltételekre. A fiziológiai állapotváltozások tehát a különböző fluoreszcencia arányokban (F440/F690, F440/F740, F690/F740) jól tükröződnek, ezért ezeknek a mutatóknak nagy diagnosztikai jelentősége van.

A vörös és a távoli vörös tartományú emissziós maximumért elsősorban a PSII reakciócentrumában és antennájában lévő klorofill-a molekulák a felelősek, a távoli vörös tartományú emissziót azonban a PSI fluoreszcenciája is befolyásolja, mely erőteljesen függ a levél hőmérsékletétől. Szobahőmérsékleten a PSI fluoreszcenciájának hatása a vörös/távoli vörös emissziós hányadosra elenyésző. Bár szerves oldószerekben oldva a klorofill-b molekulák is mutatnak emissziót, ez azonban intakt növényben a klorofill-b és klorofill-a közötti hatékony energiatranszfer miatt nem jelentkezik. Az epidermiszen átjutó UV fény által gerjesztett klorofill fluoreszcencia a reabszorpció miatt csak a viszonylag külső sejtrétegekből származhat. Alacsony klorofilltartalmú levelek esetében azonban mélyebb rétegek is forrásai lehetnek az emissziónak. A levelek adaxiális és abaxiális felszínéről eltérő intenzitású fluoreszcencia, és különböző vörös/távoli vörös emissziós hányados mérhető, ugyanis a levél leggyakrabban aszimmetrikus szöveti felépítése, valamint a szivacsos és a paliszád parenchima közötti strukturális különbség eltérő módon változtatja meg a vörös tartományú emissziót a reabszorpció révén. Laboratóriumi körülmények között nevelt növények, melyek a mesterséges fényviszonyok közt alacsonyabb UV-hányadot kapnak, s emiatt a szabadföldi növényeknél kevesebb fotoprotektív anyagot halmoznak fel az epidermiszben, jóval magasabb klorofill fluoreszcenciát mutathatnak, mint a természetes fényen nőttek. Olyan stresszhatások, mint pl. a nehézfémek, vagy az esszenciális tápelemek hiánya módosíthatják mind a vörös-távoli vörös, mind a kék-zöld fluoreszcenciát, így a tünetek erőssége, közvetve a stresszeltség mértéke, s annak a levél felületén tükröződő eloszlása jól mérhető a fluoreszcencia leképezéssel.

Mint már említettük a kék és a zöld fluoreszcencia reabszorpciója is szerepet játszik az arányok változásában, a zöldé azonban lényegesen kisebb mértékű, mint kéké – mivel a klorofill-a-nak e spektrális régióban nincs elnyelése – és ezért a klorofilltartalom csökkenésekor az F440/F520 fluoreszcencia arány csökkenhet. A változás azonban nem lehet nagyon jelentős, hiszen a kék-zöld fluoreszcencia túlnyomó része a klorofillt nem tartalmazó bőrszöveti sejtekből származik, ezért az önabszorpció eleve csak a kék-zöld fluoreszcencia kisebb, mélyebb rétegekből származó részét érintheti. Bizonyos kórokozók, pl. növénypatogén gombák önmaguk által emittált fluoreszcencia révén is fokozhatják a kék-zöld fluoreszcencia intenzitását, így ilyen esetekben a felvételek értékelésénél ezt is figyelembe kell venni. A stressz típusa és a növény válaszreakciója határozza meg, hogy mely fluoreszcencia arányok csökkennek és melyek nőnek. A fluoreszcencia arányoknak a stresszorok hatására bekövetkező változásainak irányát mutatja az 5.1. táblázat.

5.1. táblázat

A kék/vörös (F440/F690), kék/távoli vörös (F440/F740), vörös/távoli vörös (F690/F740) és kék/zöld (F440/F520) fluoreszcencia arányok, mint stressz indikátorok mértékének változásai különböző stresszorok hatására a kezeletlen növényhez képest. ++ = jelentősen magasabb, + = magasabb, – – = jelentősen alacsonyabb, = alacsonyabb, 0 = nincs szignifikáns változás (Buschmann et al., 2000 nyomán, kiegészítve, Szigeti et al., 2008)

stresszor

F440/F690

F440/F740

F690/F740

F440/F520

Vízhiány

+ +

+ +

0

0

Nitrogénhiány

+ +

+ +

+

0

Erős fény

+ +

+ +

+

– –

Levéltetű szúrás

+ +

+ +

0

+

Levélrozsda fertőzés

+ +

+ +

+ +

Hőstressz

– –

– –

0

UV A-stressz

– –

– –

0

+

Fénygátlás

+ +

+ +

– –

0

Paraquat kezelés

+

+

Kadmium-stressz

+

+

+

Diuron kezelés

– –

– –

+

0

A szokásos spektrofotometriás mérésekkel szemben a fluoreszcencia leképezéssel a levél teljes felülete által emittált fluoreszcencia és annak felületi eloszlása detektálható. Az eloszlás ismeretének különösen egy stressznek vagy patogénfertőzésnek a kezdeti stádiumában van jelentősége, mely hatások csak ritkán érintik egyformán a levél teljes felületét, hanem a hatás természetétől függő módon, például a patogének (vírusok, baktériumok, gombák) levélen belüli terjedésétől függően érintik a levél egyes részeit. A tünetek heterogenitása tehát képszerűen is megragadható.