5.4. A fluoreszcencia leképező rendszer működése vázlatosan

A fluoreszcencia leképező rendszerben (5.2. ábra) a növényi minta fluoreszcenciáját egy 16,7 Hz-cel villogó (flash) xenonlámpa (FX-300UV, Perkin Elmer Optoelectronics, Cambridge, UK) gerjeszti, amely elé egy UV áteresztő szűrőt (DUG 11, Schott, Mainz, Germany, 340 nm) helyeztek el. A lámpát a leképezendő mintától 45-50 cm-re helyezzük el, úgy, hogy a gerjesztő fénysugár kb. 60-65°-os szöget zár be a minta síkjával.

A fluoreszcencia leképező rendszer vázlata.

5.2. ábra. A fluoreszcencia leképező rendszer vázlata.

A minta által emittált fluoreszcencia egy optikai és erősítő rendszeren keresztül jut a CCD kamerába (Photonetics, Kehl, Germany). A szűrők (LOT-Oriel, Darmstadt, Germany) egy a kamerába beépített szűrőtartóban a kamera lencséje után találhatók, amelyek a szoftver segítségével történő változtatással, a fény útjába helyezésével teszik lehetővé a négy hullámhossz tartományban az emittált fluoreszcencia áteresztését és leképezését. Ez a négy hullámhossz a kék tartományban 440 nm, a zöldben 520 nm, a vörösben 690 nm, a távoli vörösben pedig 740 nm. A kamera nyitását a xenon lámpa felvillanásával szinkronizáljuk egy antenna révén, ami a villogó xenon lámpát gyújtó áramot biztosító kábel elektromágneses terét érzékeli. A kamera működését számítógép vezérli. A képek rögzítését a Camille 1.04, korrekcióját, kiértékelését a Camille 1.05 szoftver (Photonetics, Kehl, Germany) alkalmazásával végezzük. A kis intenzitású fluoreszcens jel felerősítése részben a kamerára adott feszültséggel, de inkább több száz gerjesztő fényfelvillanás alkalmazásával történik. Minden mintáról mind a négy hullámhossznál általában 400-400 képet összegezünk (de ez a szám a fluoreszcencia intenzitásától függően változtatható), majd ugyanennyi képet veszünk fel a gerjesztő fény alkalmazása nélkül, ami a háttér spontán fluoreszcenciájának meghatározására szolgál, amit a villogó gerjesztő fénnyel kapott képek összegéből levonunk.

A jó minőségű képalkotást számos méréstechnikai buktató nehezíti. Problémát jelenthetnek nagy vastagságbeli kiterjedéssel és változatossággal (redőkkel, kiugró erezettel) rendelkező levelek. A méréshez alapvető fontosságú, hogy az UV gerjesztő fény lehetőség szerint egyenletesen érje a levél felületét. Ez gyakorlatilag nem oldható meg, tekintettel arra, hogy a gerjesztő fény beesésének szöge nem azonos a detektálás 90°-os szögével. Viszont megfelelő korrekcióval a megvilágításnak ebből következő egyenetlenségéből adódó fluoreszcencia intenzitás különbségek kiküszöbölhetők (részletesebben lásd később), de a levél görbületeinek, redőzöttségének hatásai nem eliminálhatók. Folyamatosan figyelni kell a detektorba jutó nem fluoreszcens fény és a kamera belső zajának szűrésére, és a lámpa-kamera szinkron megtartására. Ez utóbbi azért fontos, mert a kamera impulzus üzemmódban működik, azaz csak akkor nyílik, amikor a gerjesztő xenonlámpa is villan. Ha e kettő nincs szinkronban, akkor sok kép veszhet el, s ez a valós fluoreszcencia intenzitás helyett lényegesen alacsonyabb értéket eredményez.