5.5. A fluoreszcencia leképezéssel kapott képek kiértékelése

A kiértékelést a Camille 1.05 programmal végezzük. A File menü Open Sequence parancsával (Shift+S) a megfelelő fájlnév beírásával behívható egy 440-520-690-740 nm-en felvett képsorozat. Valamennyi kép láthatósága érdekében a Window/Tile paranccsal mozaikszerűen jelenítsük meg a négy képet.

A kiértékelés során az első lépés a gerjesztő fény inhomogenitásának, a mintát érő gerjesztő fény egyenetlenségének a figyelembe vétele, ami úgy történik, hogy a minta helyett egy fehér papírlapot megvilágítva a fehér papír 440 nm-nél emittált fluoreszcenciájával korrigáljuk a képeket (uniformity correction, 5.3. ábra).

Egy fehér papír 440 nm-nél mért fluoreszcenciája, amely a megvilágítás inhomogenitásának korrekciójára szolgáló felvétel.

5.3. ábra A megvilágítás inhomogenitásának korrekciójára szolgáló felvétel, ami egy fehér papír 440 nm-nél mért fluoreszcenciája alapján mutatja a megvilágítás egyenetlenségét (fent), illetve a felvétel horizontális profilja a felső képre húzott vonal mentén (lent).

Ehhez először be kell hívni a korrekciós képet. (Uniformity/Load uniformity image), majd képenként elvégezni a korrekciót (Processing/ Uniformity Correction, vagy Shift+U). A korrigált képek ilyenkor általában túl világosak lesznek, ilyenkor a – gombbal lehet csökkenteni a fényerőt, úgy hogy a lehető legtöbb részlet láthatóvá váljék.

A háttér zavaró jeleinek eliminálása érdekében, a 690 nm-es képet alkalmazva készítsünk egy bináris maszkot (Binary mask/Create). A cél az, hogy a levél minél jobban elváljon a háttértől. A maszk két szélső értékének olyan értéket kell választani, amellyel a képen a háttér minél inkább fekete, míg a levél képe színes. A bináris maszk készítése során a legmagasabb intenzitású – a fekete-fehér képeken fehér színű – területek piros, míg a legkisebb intenzitású, fekete területek sötétkék színben jelennek meg. Az elkészített maszk bmp fájlban elmenthető (Binary mask/Save), majd minden – ugyanazon mintáról készült – képre külön-külön alkalmazandó (View/Apply the binary mask). Az így megváltoztatott képek új sorozatban is elmenthetőek: File/Save Sequence. Ha nem akarjuk a teljes levél fluoreszcencia értékeit átlagolni, hanem csak egyes területeire vagyunk kiváncsiak – főleg akkor, ha a levél fluoreszcenciája nagyon heterogén – akkor az egyik képen kijelölhető egy vizsgálni kívánt téglalap alakú terület (region of interest: ROI, 5.4. ábra) és ez a kijelölés a ROI/Duplicate (Ctrl+D) paranccsal az adott képsorozat többi tagjára is átvihető. Ez a terület, a ROI el is menthető. A kijelölt ROI átlagos intenzitásértékeit a Processing/Sequence Intensity Ratio (Ctrl+I) paranccsal lehet megjeleníteni. A kijelölésnél vigyázni kell arra, hogy a háttér elemei ne kerüljenek bele, mert a háttér alacsony intenzitásértékei befolyásolják a meghatározni kívánt terület átlagértékeit.

A vizsgálandó levél egy területének (ROI) kijelölése és az adott területre jellemző intenzitás átlagok megjelenítése a képernyőn.

5.4. ábra A vizsgálandó levél egy területének (ROI) kijelölése (jobbra) és az adott területre jellemző intenzitás átlagok megjelenítése a képernyőn (balra).

A fenti paranccsal kiírt átlagértékek a Copy Mean Values to Clipboard paranccsal kimásolhatók és pl. Excel táblázatba beilleszthetők, de ilyenkor a tizedespontokat azonnal tizedesvesszőkre kell cserélni. A szűrők különböző érzékenységét a gyártó által megadott korrekciós tényezők (440 nm-nél: 0,40, 520 nm-nél: 1,00, 690 nm-nél: 0,71, 740 nm-nél: 0,58) alkalmazásával vesszük figyelembe. Az átlagnak a szűrők érzékenységi faktorával korrigált értékeit is ismeri a program, de kimásolni csak a korrigálatlan értékeket lehet, ezért egy előre elkészített Excel-korrektort érdemes használni, amibe a korrigálatlan értékeket beírva, az adott hullámhosszhoz tartozó szűrőparamétereket beadva, megkapjuk az adott hullámhosszra érvényes, korrigált fluoreszcencia intenzitás értékeket.

Egy adott képen egy-egy pont, vagy egyenes, illetve a kijelölt ROI átlagos, legalacsonyabb és legmagasabb intenzitásértékeit is megmutatja a program, ha a menü alatti ikonsor elemére kattintunk. Ekkor az adatok (pl. korrigálatlan átlag, szórás, minimum, maximum) a programablak alsó sorában leolvashatók. A hamisszín-hozzárendelés esetén (lásd később) a színskála határainak megadásakor e szélső értékek ismerete fontos lehet.

A Processing/Histogram paranccsal (Ctrl+H, vagy ikon) az aktív kép teljes egészének, vagy ha van kijelölt ROI, annak a hisztogramját lehet megkapni, ami megmutatja, hogy az egyes intenzitásértékek hány pixelen fordulnak elő (5.5. ábra).

A vizsgált felület fluoreszcencia intenzitásának gyakoriságát mutató hisztogram.

5.5. ábra Egy adott levél, vagy azon kijelölt terület (ROI) fluoreszcencia intenzitásának gyakoriságát mutató hisztogram.

Ugyanebben a menüben található a horizontális és vertikális profil felvételének parancsa. Az előbbi (Shift+H, vagy ikon) pl. megmutatja, hogy egy sávban mennyi a pixelek intenzitásösszege, illetve egy adott vízszintes egyenes mentén mekkorák az egyenes mentén levő pixelek intenzitásértékei. Egy alkalmazási lehetőséget mutatunk be az 5.6. ábrán egy kínai kel levelén szemléltetve a zöld és a távoli vörös fluoreszcencia eloszlását egy egyenes mentén a horizontális profil felvétel segítségével. Az ábrán látszik, hogy az erek kiugróan magas zöld fluoreszcenciát mutatnak, míg a távoli vörös fluoreszcencia az erekben csökkent értékeket mutat.

Kínai kel levél fluoreszcencia leképezése 440, 520, 690 és 740 nm-nél. Horizontális profil az 520 nm-nél és 740 nm-nél felvett képen feltüntetett vonal mentén.

5.6. ábra Kínai kel levél fluoreszcencia leképezése 440, 520, 690 és 740 nm-nél (balra). Horizontális profil az 520 nm-nél (felül) és 740 nm-nél felvett képen (alul) feltüntetett vonal mentén (jobbra).

A Camille 1.05 program segítségével, az egyes képekkel számítási műveleteket is lehet végezni, pl. a klorofilltartalom változásának bemutatásához szemléletes a 690, ill. 740 nm-en felvett fluoreszcencia kép hányadosa (F690/740), amely érték fordítottan arányos a klorofilltartalommal. A két – arányba állítani kívánt – képpel a Processing/Arithmetic Operations (Shift+O, vagy ikon) paranccsal végezzük el a műveletet, ami a két kép pixelenkénti intenzitásértékeinek osztásával adja a hányadosképet. Mivel a keletkező képen a hányadosértékek nagyon alacsonyak lesznek, egy szorzást is kell alkalmazni a műveletben, mely szorzó faktor értéke az arányképek egyes pontjainak nagyságrendjétől függ, ez lehet pl. 100, vagy 1000. Az így kapott értékek – pl. a hamis szín hozzárendelésekor – már könnyebben kezelhetők lesznek.

Az egyes hullámhosszaknál felvett fluoreszcencia képeket az intenzitástól függően hozzárendelt színekkel tesszük szemléletesebbé. Ezt a műveletet nemcsak a Camille 1.05 programmal, hanem az ImageJ szoftverrel is elvégezhetjük. A Camille 1.05 programból bmp kiterjesztéssel kell elmenteni azt a fájlt, amelyet ebben a programban kívánunk megnyitni. A Plugins/ LUT Panel 2.2/ Gradient LUT paranccsal lehet előhívni a színezéshez használható színskála-beállító táblát (LUT: Lookup table). 2-5 szín beállítása választható, érdemes kihasználni a maximális lehetőséget. Az első szín (Define color 1) fog tartozni a legkisebb intenzitású területekhez, az ötödik a legnagyobbhoz. Ha nagyjából egyenletesen választunk színeket a színskála területéről, a hamisszínezés is szimmetrikus lesz, ellenkező esetben az intenzitástartomány adott részét finomabb, más részét durvább színfelbontással képezzük le. Egy lehetőség pl.: kék/fekete – piros – narancs – sárga – fehér. A zöld színt a levél színére való asszociálás miatt el lehet kerülni. A beállított színskála elmenthető (Export LUT).

Ezt a képet 24 bites bmp formátumban célszerű kimenteni. Ehhez pl. az Image/Type menüben a 8 bit mélységet RGB formára kell alakítani. Az elmentett bmp fájl megnyitható Paint programban, ahol a Kép menüben átlátszóvá kell alakítani a képet. Egy bármilyen képszerkesztő programban megnyitva az ehhez a sorozathoz tartozó és bmp kiterjesztéssel korábban elmentett bináris maszkot és azt rámásolva az átlátszóvá tett hamisszínes képre, a háttér nagy része kiszűrhető: Ez a kép, illetve az ebből négyszöges, vagy szabadkézi kijelöléssel kivágott levél képe elmenthető szintén 24 bites bmp formátumban.