6.3. Készülék típusok

A Clark-típusú elektródok alapvetően kétféle mintatartóval készülhetnek. A nyitott mintatartójú készülékek elsősorban vizes oldatok pillanatnyi oxigén koncentrációjának meghatározására alkalmasak. Pl. természetes vizek oxigéntartalmának mérése, hordozható, elemes készülékkel. Az ilyen típusú műszerek a légzésintenzitás, illetve a fotoszintetikus oxigén evolúció időbeli követésére, kinetikai mérésekre kevésbé alkalmasak. Az ilyen méréseket zárt mintatartóval rendelkező készülékekkel lehet pontosan elvégezni. Bár az O2-elektródok működési elve azonos, a készülékek felépítése különbözik. Ezért a mérés előtt az adott készülék műszaki leírását és használati utasítását célszerű áttanulmányozni.

6.3.1. A Hansatech gyártmányú O2-elektród (6.1. ábra)

6.3.1.1 A készülék összeállítása

Az elektród (1) összeállítása: a Pt elektródot tartalmazó körbefutó vályúba elektrolit oldatot pipettázunk. Cigarettapapírból egy olyan méretű korongot vágunk ki, amely befedi az Ag elektródot tartalmazó kúpos részt és mindenhol beleér az elektrolitba. Ezután a membránszalagból is egy hasonló méretű korongot vágunk ki és ráhelyezzük az elektród kúpos részére. A membránfeszítő eszközre (2) felhúzunk egy megfelelő méretű gumigyűrűt (3) és rányomjuk a kúpra úgy, hogy a gumigyűrű a kúp oldalán körbefutó bemélyedésbe illeszkedjen. Az elektródtest külső vájatába behelyezünk egy gumigyűrűt (3). Ellenőrizzük a membrán épségét, valamint az esetleges buborékok jelenlétét. Ha a membrán alatt buborék van, újra elvégezzük az elektród előkészítését.

Ha gáztérben történő mérést végzünk, ráhelyezzük az elektródot a háromrészes kamra alsó egységére (4). Ellenőrizzük a középső egység (5) szemben lévő részén, hogy az elektród kúpos részéhez illeszkedő gumigyűrű (3) a helyén van-e, majd az alsó (4) és középső (5) kamraegységet összecsavarjuk, hogy szorosan illeszkedjen, de azért nem erőltetve az összehúzást. A készülék harmadik, záró egységét (6) a megfelelő gumigyűrű (3) behelyezése után, nyitott csapokkal (7), összezárjuk, és a készüléket csatlakoztatjuk a vezérlő egységhez (8), majd azon keresztül a számítógéphez, amin behívjuk a programot (Oxylab V1.10)). Ha szükséges, elvégezzük a kalibrálást, illetve ellenőrizzük az elektród működőképességét úgy, hogy a kilélegzett levegőt az egyik csapon keresztül a kamrán átfújjuk. Az elektród jóságát a képernyőn a görbe gyors csökkenése mutatja.

A Hansatech-típusú O2-elektród részei.

6.1. ábra. A Hansatech-típusú O2-elektród részei. A számozott részek leírását lásd a szövegben.

6.3.1.2 Mintaelőkészítés

A levélből ismert felületű korongot vágunk ki, akkorát, ami lehetőleg kitölti a mintakamrában (5) rendelkezésre álló felületet. A korong tömegét is lemérjük és a levélanyagból klorofilltartalmat határozunk meg. Így az oxigénfogyást, illetve termelést felületre, tömegre és klorofill tartalomra is tudjuk vonatkoztatni. A kamratérbe (5) először egy középen zárt fémhálót (9) teszünk, ami védi az elektródot a közvetlen fénytől, majd egy filckorong (10) következik, amire a nátriumbikarbonát oldatot csepegtetjük. Erre jön a levélkorong és végül egy fémrács (11). Ezután a készülék harmadik, záró egységét (6), nyitott csapokkal (7), a két kapocs (12) segítségével összezárjuk, és zárjuk a két csapot is. A készülékhez csatlakoztatjuk (13) a termosztát vezetékeit, és megindítjuk a víz keringését. A Start gombbal indítjuk a mérést. Előtte beállítjuk az y tengelyen a méréshatárt és az x tengelyen a mérési időt (Graph – set axis). Először sötétben felvesszük a légzés oxigénfogyasztását tükröző alapvonalat, majd felülről megvilágítjuk a mintát. A megvilágítás intenzitását fénymérővel mérjük. Néhány perc után leállítjuk a mérést (Stop), és az eszközök menüből (Tools) kiválasztjuk az egyenes illesztési funkciót (get rate). Mind a légzési görbére, mind a fotoszintetikus oxigéntermelést mutató görbe szakaszokra egyenest illesztünk. Az értékeket az egér bal gombjának megnyomásával kaphatjuk meg. A fotoszintetikus oxigéntermelést a légzés és a fény okozta oxigéntermelés algebrai összegével számoljuk. Az adatokat és a görbét elmentjük a gépre, vagy floppy lemezre (File – Save). A korábbi adatokat a File – Load funkcióval hívhatjuk elő.

A folyadékban történő mérés esetén (kloroplasztisz, vagy alga szuszpenzió) az elektród (1) előkészítése megegyezik a fentebb leírtakkal, de a készülék felső egysége (14) más. Ez az egység egy mérőküvettát tartalmaz, amelyet az alsó egységgel (4) kell összecsavarozni (gumigyűrű - 3). A minta a küvettába kerül, aminek kb. 1.5 ml a térfogata. A küvetta egy csavaros, kapillárist tartalmazó résszel (15) zárható úgy, hogy annak homorú, alsó plexi része a mintaoldat felszínét buborékmentesen elérje. A készüléket csatlakoztatjuk a termosztáthoz (13), illetve a vezérlő egységen (8) keresztül a számítógéphez. A megvilágítás a készülék oldalán kialakított nyíláson (16) keresztül történik.

6.3.1.3 Az O2-elektródok kalibrálása

Az O2-elektród kalibrálása általában két pontra történik, egy adott hőmérsékleten. Oldatban történő mérés esetén, a kalibrálás a levegővel telített mintaoldat oldott O2 tartalmára (100%), illetve az O2-mentes mintaoldatra kapott jel ismeretében (0%), vagy ismert mennyiségű O2 koncentrációváltozást előidéző kémiai reakcióval történhet. A mintaoldat oxigénmentesítése történhet egyéb, nem sztöchiometrikus kémiai reakcióval is (pl. Na2S2O4 + O2 + H2O → NaHSO4 + NaHSO3, vagy 2Na2SO3 + O2 → 2Na2SO4), vagy szulfitokkal, pl. Na2SO3-tal. Gáztérben való mérésnél a kalibrálás a levegő oxigéntartalmára (100%), illetve oxigénmentes gázra (argon, nitrogén gáz, szén-dioxid) történik.

6.3.1.4 Mérési körülmények

Zárt rendszerben való fotoszintetikus oxigénfejlődés méréséhez megfelelő CO2 koncentrációt (min. 350 ppm) kell biztosítani, amely a fotoszintézis sebességét általában nem limitálja (a 350 ppm a legtöbb növény fotoszintézisét limitálhatja, a megvilágítás erősségének függvényében is). Mind a túl magas, mind a túl alacsony CO2 koncentráció károsan befolyásolja a fotoszintetikus oxigénfejlődést. Ha mérés gáztérben történik, a megfelelő szén-dioxid koncentrációt 1 M bikarbonát oldattal lehet biztosítani a kamrában, azaz pótolni a mérés során megkötött CO2-ot (NaHCO3 → NaOH + CO2), kb. 200μl mennyiséggel. Oldatban történő mérés esetén a megfelelően megválasztott puffer biztosítja a szén-dioxidot.

Az elektród működését kilélegzett levegő átfújásával is lehet ellenőrizni, mivel a normál levegőben 21% az oxigén és 0.035% a CO2, míg a kilélegzett levegőben kb. 14% O2 és 5% CO2 van, amely oxigénkoncentráció különbségeket a rendszer érzékeli.

Fotoszintetizáló növényi minta (levéldarab, vagy alga szuszpenzió) mérésekor a mintát néhány percig sötétben tartjuk, és felvesszük a légzési alapvonalat. Intakt fotoszintetikus rendszerek esetén az alapvonal negatív meredekségű, jelezve a légzés által elfogyasztott oxigént. Izolált kloroplasztiszok, vagy tilakoid membránok esetében az alapvonal meredeksége elvben nulla (ettől eltérést a hőmérséklet változása vagy az elektród instabilitása okozhat). Az alapvonal felvétele után a mintát megvilágítjuk és az egyensúlyi állapot beállta után meghatározzuk a fényindukált és a sötétben mért jel meredekségének különbségét. Ez az érték megfelelő kalibrálás esetén a minta oxigén fejlesztésének sebességét adja. A növényi minták oxigén fejlesztésének tradicionálisan használt mértékegysége a µmol O2 mg-1 klorofill h-1, de az oxigéntermelés megadható levélfelületre, levéltömegre, kloroplasztisz, illetve algasejt számra is.

Az oxigén koncentráció változásának mérése során általában különböző állapotú mintákat kell összehasonlítani, ezért relatív összehasonlításra van lehetőség. Ezt a mérés során kapott görbék meredekségének összevetésével lehet megtenni, és ilyen esetekben a készülék kalibrálása elhagyható.