6.5. Kloroplasztiszok intaktságának mérése K3[Fe(CN)6] redukció alapján

A K3[Fe(CN)6] (K-ferricianid), mint Hill-oxidáns nem tud átjutni a kloroplasztiszok borító membránján, de elektron donorként reakcióba lép a szabad tilakoid membránok elektrontranszport láncaival a következők szerint: 2 H2O + 4Fe3+ → 4Fe2+ + 4H+ + O2 + 4 e-.

100% intakt kloroplasztiszt tartalmazó oldat megvilágításakor, K-ferricianid jelenlétében, nem kapunk oxigénfejlődést, míg ozmotikus sokkal szabaddá tett tilakoidok maximális oxigén termelést mutatnak.

Az izolált kloroplasztiszokat reszuszpendáló pufferben (RS) kell felszuszpendálni úgy, hogy a klorofill tartalmuk kb. 1 mg klorofill ml-1 legyen. A két reakcióelegy azonos összetételű, csupán abban különbözik, hogy a 1-es „intakt”, a 2-es széttört kloroplasztiszokat tartalmaz.

A reszuszpendáló oldat összetétele: 330 mM szorbitol (szaharóz), 2 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 50 mM-os HEPES-KOH (pH 7.6), és esetleg 0.2% BSA. Az oldat pH-ját KOH-val kell beállítani.

  1. reakcióelegy és mérés: 1 ml 2 x tömény RS oldat + 0.8 ml bidv + 10 µl K-ferricianid (2 M-os), 10 µl D,L-glicerinaldehid (0.5 M-os) + 0.1 ml intakt kloroplasztisz szuszpenzió – sötétben 1 percig kevertetni a mérőküvettában, majd 10 µl NH4Cl-t (0.5 M-os) hozzáadni – mérés fényen, majd a meredekség leolvasása (V1)

  2. reakcióelegy és mérés: 0.8 ml bidv + 0.1 ml kloroplasztisz szuszpenzió 1 percig keverés (ozmótikus sokk), majd hozzáadjuk a többi komponenst az 1-es mérés szerint. A meredekséget leolvasva kapjuk a V2-t.

A mérés során a D,L-glicerinaldehid a CO2-fixációt gátolja, ezáltal megakadályozva a CO2-függő O2 fejlődést intakt kloroplasztiszokban, de nincs hatással a fotoszintetikus elektrontranszport láncra. Az NH4Cl szétkapcsolóként működik és a K-ferricianid hatását erőteljesen fokozza, mivel kiküszöböli a protongradiens időt igénylő felépülése okozta retardációt, illetve a foszforilációs kontrollt kikapcsolja.

Az izolált kloroplasztiszok intaktságát az alábbiak szerint lehet számolni:

(V2 – V1)/V2 x 100 = intakt plasztisz %