7.2. Klorofill-a fluoreszcencia indukció

A fotoszintetikus aktivitás változásának követésére széles körben elterjedt a klorofill-a fluoreszcencia indukciójának (a fotoszintetikus elektrontranszportlánc működésének hatására változó fluoreszcencia intenzitás) mérésén alapuló módszer. Kautsky és Hirsch (1931) fedezte fel, hogy a fluoreszcens jel és a fotoszintetikus elektrontranszportlánc állapota közt szoros összefüggés van, melynek alapja az alábbi egyenlettel felírható törvényszerűség:

Eabszorbeált = Efotoszintézis + E + Efluoreszcia

.Mivel a fotoszintetikus elektrontranszportlánc meghajtására fordított gerjesztési energia mennyisége közvetlenül nem mérhető, mértékére a fluoreszcencia-hozam segítségével tudunk következtetni. A klorofill-a fluoreszcencia indukció használatát nagyban elősegíti, hogy a vizsgált növény roncsolása nélkül is alkalmas a stressz-válaszok nyomon követésére. Butler (1978) modellje szerint a reakciócentrumként funkcionáló P680 klorofill-a dimert gerjesztve (P680*) a dimer kétféleképpen adhatja le a gerjesztési energiáját: a PSII kinon akceptorára (QA) történő elektronátadás esetén nem történik fluoreszcencia kibocsátás: ezt a jelenséget fotokémiai kioltásnak nevezi a szakirodalom (bár szorosan vett értelemben itt nem kioltásról, hanem a fényenergiának a fotoszintézisben történő hasznosulásáról van szó). Amennyiben az elektrontátadás valamilyen okból gátolt, az alapállapotba való visszatérés nagyobb hatékonyságú fluoreszcencia kibocsátással párosul. Azokat a PSII reakciócentrumokat, amelyek QA akceptora oxidált állapotban van, nyitott reakciócentrumoknak nevezzük, míg a QA redukálódása esetén zárt állapotról beszélhetünk. A PSII reakciócentrumok működési hatékonysága és állapota tehát erőteljesen befolyásolja a mérhető aktuális fluoreszcencia-hozamot (F). A levelek fluoreszcencia emissziója a következőképpen definiálható:

F = I*Alevél*FRPSIIF

ahol I a levelet érő fény intenzitása (fotoszintetikusan aktív foton fluxus denzitás, PPFD), Alevél a fotoszintetikus pigmentek fényelnyelésének mértékét jellemző hányados, FRPSII a fotoszintetikus apparátus abszorpciójából a PSII részesedése és ΦF a fluoreszcencia kvantumhozama. A fluoreszcencia kvantumhozamát a ΦF hányadossal definiálhatjuk (kibocsátott fluoreszcens fotonok száma/elnyelt fotonok száma). A ΦF hányados felírható a gerjesztett állapotból az alapállapotba való visszatéréshez vezető különböző reakcióutak sebességi állandóinak segítségével is:

ΦF = kF/(kF + kH + kPP)

ahol kF, kH és kP a fluoreszcencia, hőkibocsátás és fotokémiai kioltás sebességét jellemző állandó, P pedig az aktuálisan nyitott PSII reakció centrumok arányát jelöli.

Néhány percig sötétben tartott levelekben a PSII reakciócentrumok elektron-akceptorai oxidálódnak, azaz fokozatosan mind nyitott állapotba kerülnek (P=1). A sötétadaptált leveleket kis intenzitású, modulált fénnyel (PPFD ~ 0,1 μmol foton m-2 s-1) megvilágítva a megvilágítás kezdettől számított 30-40 μs időskálán a fluoreszcencia hozam egy lokális maximumot ér el, ezt Fo értéknek (alap fluoreszcencia, O-pont) nevezzük. (Sokszor tévesen F0 értékként találkozhatunk az alap fluoreszcenciával, amely jelölés azonban téves, az eredeti elnevezés ugyanis az oligomicin-érzékeny fluoreszcenciából [Fo] származik.) Az alap fluoreszcenciáért főként az antennakomplexek fluoreszcens emissziója felelős. Mivel nyitott állapotban P=1, a fluoreszcencia hozam

ΦF = kF/(kF + kH + kP)

Az Fo fluoreszcencia kialakulása után a leveleket telítési fénnyel megvilágítva (PPFD ~ 2000 μmol foton m-2 s-1) jellegzetes lefutású fluoreszcenciahozam-változásokat mérhetünk. A fluoreszcencia hozam (7.1. ábra) meredeken emelkedni kezd (a reakciócentrumok záródnak), majd a megvilágítás kezdetétől számított 2-3 ms-ot követően lokális telítést mutat (J-pont), amely telítés egyik fő oka a P680+ és a QA- közötti stabil töltés-szeparáció. A fluoreszcencia hozam további emelkedésének letörésében a vízbontó centrumtól származó elektronok megjelenésének van szerepe (I-pont), a megvilágítás kezdetétől számított 60-70 ms időintervallumban. Végül a fluoreszcencia hozam időgörbéje egy utolsó telítést is mutat 110-120 ms időben (P-pont, Fp). Ha a folytonos megvilágítás lelíti a PSII elektrontranszportot (a reakció centrumok zárt állapotba kerülnek), maximális fluoreszcenciáról (Fm) beszélünk. A fluoreszcencia hozam emelkedését a QA és a QB kinon akceptor között meginduló elektrontranszport töri. P-pontban a zárt reakciócentrumok fluoreszcencia hozama:

ΦF = kF/(kF + kH)

Sötétadaptált levelek megvilágítás hatására kibocsátott fluoreszcencia hozam emelkedése 1 s idő intervallumon belül. A jellegzetes lefutású hozam emelkedés lokális telítési pontokon halad keresztül – a részletes magyarázatot ld. a szövegben.

7.1. ábra. Sötétadaptált levelek megvilágítás hatására kibocsátott fluoreszcencia hozam emelkedése. A jellegzetes lefutású hozam emelkedés lokális telítési pontokon halad keresztül. A fluoreszcencia hozam emelkedésének letöréséért a II. fotokémiai rendszer működési állapotai tehetők felelőssé (részletes magyarázatot ld. a szövegben).

A fluoreszcencia hozam emelkedését befolyásolja továbbá a PQ-pool heterogenitása, az inaktív PSII reanció centrumok mennyisége, a vízbontó rendszer állapota, és a membrán potenciál is.

A sötétadaptált levelek klorofill-a fluoreszcencia indukciójának gyors szakaszában meghatározható az Fo, Fm értéke. E kettő érték különbsége az ún. változó fluoreszcencia, Fv (7.2. ábra). A változó és a maximális fluoreszcencia aránya megmutatja a PSII reakciócentrumok maximális kvantumhatékonyságát (a PSII-ben lezajló fényeneria-átalakítás elméleti legnagyobb hatásfoka, kP):

Fv/Fm = (Fm – Fo)/Fm= kP/(kF + kH + kP)

ahol kF + kH + kP arányos a megvilágítás intenzitásával, hiszen a mérés során I, Alevél és FRPSII nem változnak. Ha a levelek sötétadaptációja nem volt megfelelő hosszúságú, a QA-pool nem tudja elérni a maximális oxidált állapotát, így a mérés során alulbecsüljük a maximális kvantumhatékonyságot (túlbecsüljük az Fo értékét). Ennek elkerülésére a mérés előtt egy rövid, távoli vörös (>700 nm) megvilágítást kell alkalmazni, amely elsősorban a PSI-et gerjeszti, ezáltal mintegy ’megszívja’ a fotoszintetikus elektrontranszportlácot az akceptor-oldalról és eltávolítja az elektronokat a QA akceptorról. Néhány magasabb rendű növény levelében és algákban jelentős redukált QA-felhalmozódás mérhető a klororespirációból származó plasztokinon-redukció miatt, mely sötétben is működő folyamat. Stressz körülmények, mint a vasháztartás zavara mellett szintén a PQ-pool részleges redukáltsága figyelhető meg, ezért az Fv/Fm meghatározása előtt a redukáltságot csökkentő távoli vörös megvilágítást kell alkalmazni, az érték alábecslésének elkerülésére.

Sötétadaptált leveleket megvilágítva a t időpillanatban mért aktuális fluoreszcenciahozam (Ft) ~ 1 s alatt eléri a maximális hozam értékét (Fm), majd fokozatosan csökken (7.2. ábra). A fényadaptáció nagyjából első egy percében jelennek meg az S és M tranziensek (lokális minimum és maximum a fluoreszcencia hozamban). E tranziensek eredete kevésbé feltárt, leggyakrabban az oxigénevolúció stabil beindulásával, a fénygyűjtő komplexek a két fotorendszer közötti megoszlásának változásával (state 1-state 2 átmenet) és a CO2-megkötés beindulásával (redukált koenzimek oxidálása) hozzák összefüggésbe. Tartós megvilágítás hatására a fotoszintetikus apparátus adaptálódik az adott megvilágításhoz (fényadaptált állapot). Fényadaptált állapotban a fluoreszcencia hozam stabilizálódik, steady-state értéket vesz fel (Fs). A fényadaptált állapothoz tartozó alap fluoreszcencia (Fo) az aktinikus megvilágítás néhány másodperces szüneteltetése, valamint távoli vörös megvilágítás alkalmazása után mérhető. A steady-state állapot a gyakorlatban úgy határozható meg, hogy egymástól 50-100 s időkülönbséggel adott telítési fényfelvillanás által kiváltott fluoreszcencia-maximum (Fm’) értékek azonosak (úgy, hogy közben az Ft értéke sem változik). A fényadaptált állapotban a maximális fluoreszcencia (Fm) alacsonyabb, mint a sötétadaptált állapotban mérhető Fm (Fm’≤Fm). Az Fm’ és a Fs értékek segítségével számítható a fényadaptált reakciócentrumok működésének hatékonyságát jellemző aktuális kvantumhatékonyság (ΔF/Fm):

ΔF/Fm’=(Fm’-Fs)/Fm

A fotoszintetikus elektrontranszport lánc működését az ETR (electron tranport rate) paraméter számításával jellemezhetjük:

ETR = ΔF/Fm’*PPFD* FRPSII *Aλ,

ahol PPFD a levelet érő fotoszintetikusan aktív besugárzás, FRPSII a PSII-n abszorbeálódó fotonok részesedése a teljes abszorbeált fénymennyiségből (ha PSI ~ PSII, akkor FRPSII = 0,5) és Aλ a levél abszorpciós koefficiense (C3 levelek esetében ~0,84).

Sötétadaptált és megvilágított levélről pulzus amplitúdó modulált (PAM) fluorométerrel regisztrálható klorofill fluoreszcencia változások. A sötétadaptált mintát modulált mérőfénnyel megvilágítva Fo fluoreszcenciát, telítési felvillanás hatására az Fm fluoreszcenciát regisztrálhatjuk, e kettő különbsége a változó fluoreszcencia (Fv). Sötétadaptált levelet aktinikus fénnyel megvilágítva kezdetben jelentősen nő, de 1-2 s után csökken a fluoreszcencia intenzitása, és a beinduló fotoszintetikus elektrontranszport következtében fokozatosan eléri az egyensúlyi értéket (Fs). Az egyensúlyi állapotban mérhető minimális és maximális fluoreszcencia hozamok az Fo’ és az Fm’ értékek. Az Fs és az Fm’ hozamok különbsége a fényadaptált állapot változó fluoreszcenciája (ΔF).

7.2. ábra. Sötétadaptált és megvilágított levélről pulzus amplitúdó modulált (PAM) fluorométerrel regisztrálható klorofill fluoreszcencia változások. M: mérőfény, A: aktinikus megvilágítás, T: telítési felvillanás. A sötétadaptált mintát modulált mérőfénnyel megvilágítva Fo fluoreszcenciát, telítési felvillanás hatására az Fm fluoreszcenciát regisztrálhatjuk, e kettő különbsége a változó fluoreszcencia (Fv). Sötétadaptált levelet aktinikus fénnyel megvilágítva kezdetben jelentősen nő, de 1-2 s után csökken a fluoreszcencia intenzitása, és a beinduló fotoszintetikus elektrontranszport következtében fokozatosan eléri az egyensúlyi értéket (Fs). Az egyensúlyi állapotban mérhető minimális és maximális fluoreszcencia hozamok az Fo’ és az Fm’ értékek. Az Fs és az Fm’ hozamok különbsége a fényadaptált állapot változó fluoreszcenciája (ΔF).

A fényadaptált állapot változó fluoreszcenciája valójában: Fv’= Fm’-Fo’. ΔF-et nem szokták így jellemezni.

7.2.1. A nem-fotokémiai kioltás (NPQ)

A sötétadaptált állapothoz képest a maximális fluoreszcencia hozamot különböző eredetű energiaveszteségek csökkentik: ez az energiamennyiség elvész a fotoszintetikus elektrontranszportlánc, különösen a PSII meghajtása szempontjából. A jelenségeket összefoglaló néven a nem-fotokémiai kioltásként (NPQ) ismert folyamatok közé sorolják. Fényfelesleg esetén, ha az abszorbeált fotonok száma nagyobb a fotoszintetikusan felhasználható fotonok számánál, egyes klorofill-protein komplexek a felesleges fény nem-fotokémiai disszipációjában is részt vehetnek. Az NPQ típusai között legjelentősebb a ∆pH-függő kioltás (qE), mely gyorsan kialakuló (20-60 s) és relaxálódó folyamat. Az elektrontranszportlánc működése során keletkező, és ATP-szintézisre nem használódó proton-gradiens hatására a tilakoid lumen savasodik, amely kiváltja a violaxantin de-epoxidáz (VDE), illetve a PsbS protein protonálódását. A protonálódott VDE aktívvá válik, és a pigment-protein komplexeken és a PsbS-en kötött violaxantin-molekulákat két lépésben, anteraxantin köztes állapoton keresztül, zeaxantinná de-epoxidálja. Csökkenő lumen savasság hatására a VDE inaktiválódik, és a zeaxantin epoxidáz működése lassan violaxantinná alakítja a xantofill-pool nagy részét (xantofill-ciklus). A violaxantin gerjesztési energiája magasabb a klorofillok gerjesztési energiájánál ezért energiát képes számukra átadni, fénygyűjtő funkciót lát el. A de-epoxidáció miatt több telítetlen kötéssel rendelkező zeaxantin viszont gerjesztési energiát képes átvenni a klorofilloktól, amely hő formájában emittálódik. A xanthofillok oxidáltsági állapotának változása befolyásolja az LHCII antennák szerveződését és aggregáltságát, amely folyamatok szintén hozzájárulnak a termikus energiakibocsátás növekedéséhez. A PsbS protein protonálódva konformációt vált, és antennakomplexekhez kapcsolódva, maga köré gyűjtve a PSII antennarendszerének egy részét, kioltó centrummá alakul.

Változó kis fényintenzitás mellett nagy jelentősége van a mobilis LHCII antennák PSII illetve PSI reakciócentrumokhoz való kapcsolódásának is, melyet state 1 – state 2 átmenetnek nevezünk. Szerepe a gerjesztési energia két fotorendszer közötti megosztásának szabályozása. PSII fényfelesleg esetén az LHCII komplexek 30%-a foszforilálódhat az LHCII kináz segítségével, amit a PQ-pool redukált állapota (a PSII túlműködése) aktivál. A foszforilált LHCII a PSII-ről leválva monomerizálódik és a PSI-hez kapcsolódva az elnyelt energiát a kevésbé fluoreszkáló PSI-re továbbítja (state 2), ezáltal a PSII fluoreszcenciájának csökkenését (qT) eredményezi. A PSII fényhiánya esetén a foszforilált LHCII az oxidált PQ által aktivált LHCII foszfatáz katalizálta reakcióban defoszforilálódik, így visszaköthet a PSII-re (state 1). E folyamaton keresztül a PQ-pool redoxállapota szabályozhatja a fényenergia megoszlását a két fotokémiai rendszer között. Gátolt lineáris elektrontranszport (LET) esetén emellett növeli a ciklikus elektrontranszport (CET) aktivitását. A qT közepes időtávon (5-10 perc alatt) relaxálódó kioltás.

Míg a qE és a qT viszonylag gyors és reverzibilis folyamatok, az NPQ egy másik, PSII inhibícióval összefüggő típusa (qI) lassan alakul ki, és gyakran irreverzibilis. A magas fényintenzitás határára kialakuló fotoinhibíció mellett a PSII működése számos más stresszhatás eredményeképpen is gátlódhat (PSII inhibíció szárazság, hideg, tápelem-hiányok és toxikus anyagok hatására), amikor gátolt reakciócentrumok tartós gerjesztése károsodásokat eredményez alacsony fényintenzitáson is. A reakciócentrumot felépítő D1 protein oxidatív károsodásai gátolják az elektrontranszportot. Az inaktivált PSII reakciócentrumok kioltó centrumokként működhetnek, amelyek gerjesztett állapota hőkibocsátással relaxálódik. Az NPQ legáltalánosabban az

NPQ = (Fm-Fm’)/Fm

egyenletből számítható. Az egyes kioltási típusok részesedésének meghatározása az NPQ egészéből a gyakorlatban azonban nem egyszerű feladat. A qE legegyszerűbben a Stern-Volmer egyenletből számítható:

qE = (Fo-Fo’)/Fo

Az alap fluoreszcencia meghatározásának nehézsége (ld. Hibalehetőségek) miatt azonban a legtöbb esetben nem nyújt pontos eredményt.

Az egyes kioltási típusok részesedésének méréséhez felhasználható a relaxációjukban mérhető időbeli eltérés. A fényadaptált levelet sötétbe helyezve és meghatározott idő elteltével (30 s, 5 min, 20 min) telítési felvillanásokkal megvilágítva egyre növekedő maximális fluoreszcencia értékek (Fm”) mérhetők. Az Fm30’’, Fm5’ és Fm20’ értékek összefüggésbe hozhatók a qE, qT és qI kioltások relaxációjával:

qE = (Fm5’- Fm’)/(Fm-Fo).(*)

qT = ([Fm- Fm 5’]-[Fm- Fm20’])/(Fm-Fo).(*)

qI = (Fm- Fm20’)/(Fm-Fo)

A gyorsan relaxálódó NPQ folyamatok (qE, qT) azonban erős időbeli átfedést mutatnak, ezért gyakran a qE meghatározásának pillanatában a qT jelentős része is relaxálódik, így elkülönítésük hibával terhelt.

A PSII inaktiváció és az energizáltság-függő kioltás részesedésének számítására Hendrickson modell adja a legjobb eredményt. A modell a teljes elnyelt gerjesztési energia megoszlását adja meg:

ΣEexc = ΦPSII + ΦNF + ΦNPQ + Φf,D = 1

ahol ΣEexc a teljes abszorbeált kvantumhozam, ΦPSII a fotokémiai kioltás, Φf,D a fluoreszcencia mértéke, ΦNPQ az antennafüggő folyamatok kioltása és ΦNF a PSII inaktivációból eredő kioltás. A gerjesztési energia megoszlásának számításához a modell használ egy kvázi inaktivációt nem szenvedett fotoszintetikus apparátus sötétadaptált maximális (FmM) és variábilis fluoreszcenciáját (FvM), a kapott eredmények ezért az adott növényre és állapotra jellemző relatív értékek. Az elnyelt fényenergia megoszlása a különböző folyamatok között a következő egyenletek szerint alakul:

,

7.2.2. Hibalehetőségek a mérésben

A steady-state állapot jellemzésekor több hiba is felmerülhet. Amíg a PSII fluoreszcenciája indukálható, addig a PSI fluoreszcenciája stabilnak tekinthető (az alap fluoreszcenciában jelentkezik), és jellemzően csak a 700 nm feletti hullámhossztartományban jelentkezik. 700 nm fölött a PSI fluoreszcenciája C3 és C4 növények esetében 30 és 50%-ban járul hozzá az Fo értékéhez. Következésképpen a PSI fluoreszcenciájának nagyobb mértékű megjelenése a fényadaptált állapotra jellemző fluoreszcencia-paraméterekben (Fs, Fm’) az aktuális kvantumhatékonyság alulbecslését eredményezik. A pusztán alacsonyabb hullámhosszú (680-700 nm) fluoreszcencia emisszió mérése a levél szöveteinek reabszorpciója miatt okoz téves eredményt. A túl hosszú idejű telítési felvillanás alkalmazása szintén negatív hatású a mérésre: a hosszú telítési megvilágítás nem csak a QA, de a PQ-pool redukcióját is eredményezi. Mivel a PQ szintén kioltó hatású, a redukálódása az Fm’ túlbecsülését okozza, amely akár a 20%-ot is elérheti. A steady-state állapotot nagymértékben befolyásolja a LET állapota. C4 növényekben, illetve alacsony légköri O2 koncentráció mellett C3 növényekben is a LET által termelt NADPH és ATP fő felhasználója a CO2-megkötés. Hatékonyságának (ΦCO2) bármilyen eredetű csökkenése gátolja a LET működését, így alábecsüljük a ΔF/Fm’ értékét. Az Fo’ meghatározása is sokszor hibával terhelt lehet, mert a steady-state állapotban a QA-pool nem oxidálható minden esetben egy rövid távoli vörös megvilágítással. Ilyen esetekben az Fo’ értéke a következő egyenletből számítható:

Fo’ = Fo/[(Fv/Fm) + (Fo/Fm’)]

feltéve, hogy a minta fotoinhibíciója relaxálódott a sötétadaptálás során, ld. qI.