7.3. Klorofill-a fluoreszcencia indukció mérése pulzus amplitúdó modulációs (PAM) fluorométerrel

A fotoszintetikus elektrontranszportlánc meghajtásához a fotoszintetizáló szöveteket megvilágításnak kell kitennünk. A fotoszintetikus apparátus a gerjesztő fény egy részét, mint láttuk, fluoreszcencia formájában emittálja, azonban az aktinikus fény nagy intenzitása mellett a gyenge fluoreszcens emissziót nehéz közvetlenül mérni. Amennyiben az aktinikus fény spektruma átfed a fluoreszcens fénnyel, a mérés gyakorlatilag lehetetlenné válik. Erre a problémára, tehát az aktinikus megvilágítás mellett az indukált fluoreszcencia mérését lehetővé tevő készülékek nagyjából harminc éve állnak rendelkezésünkre. A pulzus amplitúdó moduláció (PAM) elvén dolgozó fluorométerek az 1980-as évek közepén kerültek először forgalomba. Előnyük a közvetlen fluoreszcencia emissziót mérő klorofill-a fluorométerekkel szemben az, hogy a mérés nemcsak sötétített kamrában, hanem bármilyen megvilágítás mellett is elvégezhető. A klorofill-a alap fluoreszcenciát egy extrém alacsony intenzitású mérőfény indukálja, míg a fotoszintetikus elektrontranszportláncot egy konstans intenzitású aktinikus fény hajtja meg. Ez utóbbi szintén indukál egy, az előzőnél erősebb állandó klorofill-a fluoreszcenciát, de ezt a fázis-érzékeny detektálás eltűnteti a jelből.

A PAM fluorométerek (7.3. ábra) működésének alapja, hogy olyan változtatható nagy frekvenciájú (1,6 kHz, a pulzusok gyakorisága: μs időskála), kis intenzitású (0,05 μmol foton m-2 s-1, a mérőfény kvázi nem vált ki fotokémiai reakciót, csak fluoreszcenciát), gyors felfutású és lecsengésű vörös (λ ≤ 680 nm) mérőfény felvillanásokkal dolgozik, amelyek elhanyagolható mértékben növelik a fluoreszcencia-hozamot. A kiváltott, szintén μs időskálájú fluoreszcencia pulzusok a száloptikán keresztül először egy szűrőhöz jutnak, amely csak a λ ≥ 700 nm fotonokat engedi át. A fluoreszcens jelet egy nagy érzékenységű és széles tartományban (109) lineáris fotodióda detektor érzékeli. A digitális jel ezt követően egy pulzus-jelerősítőbe kerül, amely AC-kapcsolt, így lehetővé teszi a háttérből származó jelek szűrését. A jel sokszorozását egy szelektív erősítő végzi, amely a gerjesztő pulzus és a pulzus után néhány μs-mal mérhető fluoreszcens jel közötti különbséget erősíti fel. Ezt a különbség jelet csak nagyon gyors változások befolyásolhatnák, így kvázi konstansnak tekinthetjük.

A PAM elven működő klorofill-a fluorométerek működési elvének vázlatos rajza. A műszer által generált nagy frekvenciájú gerjesztő fényimpulzusok ugyanilyen frekvenciával kis fluoreszcenciaintenzitás-növekedést okoznak. Az emittált fény egy λ <680 nm szűrőn áthaladva éri el a mintát, amelyet párhuzamosan aktinikus fénnyel is megvilágíthatunk. A fluoreszcens jel egy λ>700 nm szűrőn keresztül érkezik a detektorba. A fluoreszcencia hozam meghatározásához a szelektív erősítő a mérőfény-pulzusok által kiváltott fluoreszcens jelet erősíti fel.

7.3. ábra. A PAM elven működő klorofill-a fluorométerek működési elvének vázlatos rajza. A műszer által generált nagy frekvenciájú gerjesztő fényimpulzusok ugyanilyen frekvenciával kis fluoreszcenciaintenzitás-növekedést okoznak. A fluoreszcencia hozam meghatározásához a szelektív erősítő a mérőfény-pulzusok által kiváltott fluoreszcens jelet erősíti fel.

A telítési fényimpulzusok szinkronizálása a mérőfénnyel úgy történik, hogy a telítési felvillanás kezdete a mérőfény-pulzusok közötti ’ablak’ közepére essen, amely kívül esik a pulzus utáni néhány μs-os mintavételezéstől. A mérőfény pulzusainak frekvenciája növelhető, amely lehetővé teszi az indukció és a relaxáció gyors kinetikájának mérését is. A mérésben el kell különíteni a hozam (yield) és az intenzitás (intensity) fogalmakat. A mérőfény modulált jele segítségével a hozam határozható meg, míg például az folytonos aktinikus, vagy telítési fény nem-modulált intenzitásemelő hatását szűri az erősítő. A rendszer lehetővé teszi így a klorofill-a fluoreszcencia mérését mind folytonos megvilágítás (pl. napfény), mind pedig a szűrőn szabadon átjutni képes távoli vörös háttér mellett. A mérőfény gyors fel- és lefutású pulzusait lézer-emissziós diódák (LED) biztosítják. A műszer felépítése szempontjából fontos, hogy minden fény (mérőfény, aktinikus fény, telítési pulzus, távoli vörös háttér) saját száloptikán keresztül éri el a mintát, ami a száloptika hatékonysága miatt fontos. A fluoreszcens jelet fotodiódák detektálják, melyekben a fotonsokszorozókhoz (photomultiplyer) képest az emelkedő fényintenzitással párhuzamosan nem növekszik a zaj mértéke. A digitálissá konvertált jelet számítógéppel regisztráljuk

7.3.1. Mérés PAM fluorométerrel

A gyakorlaton PAM 101-102-103 klorofill-a fluorométert (7.4. ábra) használunk. A műszer bekapcsolása előtt ne felejtsük el elindítani a számítógépet és a regisztráló nyomtatót, és bekapcsolni a telítési fényimpulzusokat szolgáltató lámpát (KL-1500)! A fluoreszcens jeleket a DA-100\DA-100.exe program regisztrálja. A műszer bekapcsolása után a fluoreszcencia hozamot a ’Zero offset’ gomb nyomásával alapértékre kell állítani! A maximális kvantumhasznosítás meghatározásához 15-30 percig sötétadaptálni kell a mintákat (leveleket). A leveleket speciális csipeszekkel rögzíthetjük a mérőfényt és a fluoreszcens jelet közvetítő kevert szálú száloptika végződésére (7.5. ábra). A mérőprogram numerikus üzemmódjában (N) beállíthatók a telítési fényimpulzusok időegységei, és a telítési felvillanások gyakorisága.

A PAM 101-102-103 chlorophyll fluorometer kezelőfelülete. A fluorométert bekapcsolása után a Zero offset gombbal alapvonalazhatjuk. Mérés előtt ne felejtsük el a mérőfény-impulzusokat elindítani a Pulse on kapcsolóval! A 101 egységen található kapcsolókkal (Light intersity, Gain és Damping) a mérőfény-impulzusok tulajdonságai változtathatók. A 102 egység az aktinikus fény tulajdonságait szabályozza – külső fényforrás (KL-1500) használata esetén a fényintenzitás a külső fényforrás saját szabályozóival állítható be. A 103 alegység a telítési fényimpulzusok vezérlését végzi.

7.4. ábra. A PAM 101-102-103 chlorophyll fluorometer kezelőfelülete. A fluorométert bekapcsolása után a Zero offset gombbal alapvonalazhatjuk. Mérés előtt ne felejtsük el a mérőfény-impulzusokat elindítani a Pulse on kapcsolóval! A 101 egységen található kapcsolókkal (Light intersity, Gain és Damping) a mérőfény-impulzusok tulajdonságai változtathatók. A 102 egység az aktinikus fény tulajdonságait szabályozza – külső fényforrás (KL-1500) használata esetén a fényintenzitás a külső fényforrás saját szabályozóival állítható be, ilyenkor a Timer kapcsolót Manual (Man.) állásban hagyjuk. Mérés indításakor a zöld ’Start’ gombot kell megnyomnunk, a leállításakor pedig a Timer-t állítjuk Stop állásba. A 103 alegység a telítési fényimpulzusok vezérlését végzi.

Száloptikára rögzíthető zárt és nyitott levélcsipeszek.

7.5. ábra. Száloptikára rögzíthető zárt (A) és nyitott (B) levélcsipeszek. Zárt levélcsipesz segítségével a levelek sötét- és fényadaptációja is elvégezhető, míg nyitott levélcsipesszel a fényadaptált levelek gyors mérését lehet kivitelezni.

7.3.1.1 Az elméleti maximális kvantumhasznosítás mérése

A mintát a hordozó/adapter segítségével a száloptika végére erősítjük, úgy, hogy a száloptika felülete közvetlenül a minta felszínére illeszkedjen. Ellenőrizzük, hogy a mérőpulzus kapcsoló bekapcsolt állapotban (On) áll-e. A műszer különálló hullámhossz-váltóját állítsuk távoli vörös (H) állásba, és világítsuk meg a mintát 3-4 s ideig távoli vörös fénnyel, majd váltsunk újra vörös (R) állásba. A rövid távoli vörös megvilágítással érhetjük el a QA akceptorok maximális oxidált állapotát (nyitott reakciócentrumok). A számítógép M billentyűparancsával indítjuk a telítési fényimpulzust. A telítési F görbe megjelenik a számítógép monitorán. A görbe lefutásában ellenőrizzük, hogy elérte-e a teljes telítést, valamint hogy Fm ≤ 5×Fo! Stressz körülmények között a variábilis fluoreszcencia értékének csökkenése természetes folyamat. Az értékek az Enter paranccsal fogadhatóak el. Számoljuk ki a minta maximális kvantumhasznosításának mértékét!

7.3.1.2 A tényleges (fényadaptált) kvantumhasznosítás mérése

Indítsuk el a mérőprogramot a számítógép F10→measure→numeric parancsával. A nyomtató regisztrálja a maximális kvantumasznosítás korábban mért értékeit. Ellenőrizzük, hogy az ’Actinic light control’ panel (102) időkapcsolója (Timer) kézi vezérlésben (Manual) áll-e. Az aktinikus fényt kapcsoljuk be a kontroll panel Start gombjával és az aktinikus megvilágítást szolgáló KL-1500 fényforrás kapcsolójának egyidejű elfordításával. A fényadaptáció során telítési pulzusok az impulse (Y) paranccsal adhatók manuális üzemmódban. A szoftver maximum 15 percig tud folyamatosan adatokat gyűjteni (30 ms adatmentési frekvencia mellett), ha ennél több időre van szükség a fényadaptációhoz, Esc paranccsal leállíthatjuk a mérést, majd újra elkezdhetjük, ellenkező esetben 15 min után az adataink felülíródnak az adatfájl korlátozott mérete miatt. Ha az Fm’ értéke 100 s-on belül nem mutat változást, beállt a steady-state állapot (7.6. ábra). Az Fo’ meghatározása a PAM 101-102-103 fluorométerrel csak manuálisan lehetséges, a program nem regisztrálja az értéket. Méréséhez kapcsoljuk le az aktinikus megvilágítást (KL-1500 fényforrás), és ezzel párhuzamosan váltsunk át távoli vörös lámpára. 3 s idő múlva a Timer-t kapcsoljuk ki (Stop), és a program Ft ablakából olvassuk le az Fo’ értékét (~5 s belül mért legalacsonyabb érték). Számítsuk ki az aktuális kvantumhasznosítás (ΔF/Fm’) és az NPQ értékét! Inhibíciót nem szenvedett (’kontroll’) minta maximális kvantumhasznosítási adatait felhasználva számítsuk ki a gerjesztési energia megoszlását a különböző folyamatok között!

Kiegyensúlyozott tápanyag-ellátású (A) és cink-mérgezésben szenvedő növény (B) sötétadaptált leveleiről, fényadaptáció alatt regisztrált fluoreszcenciahozam-változások. Mindkét regisztrátum az aktinikus fény felkapcsolásával indul, amely kezdetben magas fluoreszcenciahozamot indukál, a fotoszintetikus elektrontranszportlánc beindulásával párhuzamosan azonban a fluoreszcenciahozam fokozatosan eléri a steady-state állapotra jellemző értéket. A fényadaptáció során 100 s-onként kapott a levél telítési fényfelvillanásokat, melyek a maximális fluoreszcencia hozam (Fm) értékénél kisebb fluoreszcenciahozam-megemelkedéseket és -lecsengéseket eredményeztek. A regisztrátumokon piros színnel a fotokémiai kioltás (qP), sárga színel a hozam (Y), zöld színnel pedig a nem-fotokémiai kioltás (qN) program által számolt értékei jelennek meg. A cink-mérgezett növénnyel szemben a kiegyensúlyozott tápanyag-ellátású növény levelei hamarabb adaptálódtak az aktinikus megvilágításhoz. Az (A) ábrarészen a nyíllal jelöl pontban a fényadaptált levél újra sötétbe került, a 100 s-onként tovább alkalmazott telítési felvillanások egyre lassabb lecsengései a sötétadaptáció megindulását jelzik.

7.6. ábra. Kiegyensúlyozott tápanyag-ellátású (A) és cink-mérgezésben szenvedő növény (B) sötétadaptált leveleiről, fényadaptáció alatt regisztrált fluoreszcenciahozam-változások. Mindkét regisztrátum az aktinikus fény felkapcsolásával indul, amely kezdetben magas fluoreszcenciahozamot indukál, a fotoszintetikus elektrontranszportlánc beindulásával párhuzamosan azonban a fluoreszcenciahozam fokozatosan eléri a steady-state állapotra jellemző értéket. A fényadaptáció során 100 s-onként kapott a levél telítési fényfelvillanásokat, melyek a maximális fluoreszcencia hozam (Fm) értékénél kisebb fluoreszcenciahozam-megemelkedéseket és -lecsengéseket eredményeztek. A regisztrátumokon piros színnel a fotokémiai kioltás (qP), sárga színel a hozam (Y), zöld színnel pedig a nem-fotokémiai kioltás (qN) program által számolt értékei jelennek meg. A cink-mérgezett növénnyel szemben a kiegyensúlyozott tápanyag-ellátású növény levelei hamarabb adaptálódtak az aktinikus megvilágításhoz. Az (A) ábrarészen a nyíllal jelöl pontban a fényadaptált levél újra sötétbe került, a 100 s-onként tovább alkalmazott telítési felvillanások egyre lassabb lecsengései a sötétadaptáció megindulását jelzik.

7.3.1.3 Nem-fotokémiai kioltás komponenseinek meghatározása

Kapcsoljuk ki a távoli vörös megvilágítást, és állítsuk a Timer-t Manual állásba, majd adjunk a mintának 30 s múlva telítési fényimpulzust az impulse paranccsal. Folytassuk az impulzusokat 100 s időközönként, amíg az Fm” értékek stabilizálódnak. Számoljuk ki a qE és qT kioltások részesedését az NPQ-ból!