7.4. Klorofill-a fluoreszcencia indukció mérése diszkrét hullámhosszokon mérő fluorométerrel (FMM)

A PAM fluorométerek előnye, hogy háttérvilágítás mellett is képesek a fluoreszcenciahozamot mérni. Hátrányuk azonban, hogy a λ ≥ 700 nm emissziós szűrő jelentős mennyiségű PSI fluoreszcenciát engedhet át, amely különösen C4 növények esetében az aktuális kvantumhasznosítás alulbecslését eredményezheti (ld. Hibalehetőségek). Az FMM fluorométer fényforrása egy λ = 635 nm lézerdióda (500 μmol foton m-2 s-1 maximális emissziós teljesítmény). A két csatornás detektálás lehetővé teszi a klasszikus Kautsky indukciós kinetika mérését az emissziós spektrum két maximumán (vörös: λ = 690 nm és távoli vörös: λ = 735 nm). A monokrómdetektálást a diszkrét hullámhosszakon interferencia- és vágószűrők segítségével lehet elérni. Mivel FMM fluorométer esetén a fluoreszcencia indukcióját és a fotoszintetikus elektrontranszportlánc meghajtását is a gerjesztő lézer végzi, a szennyező fénytől óvni kell a mintát, jól záródó mintatartó szükséges a méréshez. A mért adatok méretének minimalizálásához a műszer szoftvere kvázi-logaritmikus adatgyűjtést végez (0,1 ms mintavételezés az első 4 ms, 1 ms mintavételezés 1 s, 20 ms mintavételezés 15 s időtartományig, utána 200 ms mintavételezés a mérés további szakaszában.

A távoli vörös fluoreszcencia eredete többrétű. Szemben a vörös fluoreszcenciával, a távoli vörös emisszió nem reabszorbeálódik a levél szövetein keresztülhaladva (ld. fluoreszcencia leképezés). A vörös fluoreszcencia re-abszorpciója csak az intenzitást befolyásolja, a hozamot nem (ld. mérés PAM fluorométerrel), az intenzitást mérő FMM esetében a jel erőssége azonban a levél szöveti felépítésétől is függ. A távoli vörös fluoreszcenciát befolyásolja a PSI alap fluoreszcenciája a fotoszintetikus apparátus felépítésétől függően (vö. C3 és C4 növények) és a kioltó antennakomplexek alap fluoreszcenciája. Mivel az FMM a klorofill-a fluoreszcencia intenzitását méri (7.7. ábra), ezért a steady-state vörös/távoli vörös fluoreszcencia arány negatívan és lineárisan korrelál a klorofill-tartalommal (ld. fluoreszcencia leképezés), így kalibráció (spektrofotometriás klorofilltartalom-mérés acetonos kivonatból) után felhasználható a klorofill-tartalom meghatározására is.

Az FMM fluorométer további sajátsága, hogy képes változtatni a gerjesztő lézer intenzitását (LP) is, amely változó intenzitású LP mellett a vörös fluoreszcencia konstans értéken tarható. A fluoreszcencia konstans értéken tartásának hatására az LP telítési görbét ír le, ami a konvencionális F lefutáshoz hasonlóan használható az aktuális kvantumhasznosítás számítására. A módszer alkalmas a fotoinhibíció indukálására is. A konstans értéken tartott vörös fluoreszcencia mellett vizsgált változó intenzitású távoli vörös fluoreszcencia mérése egyben mérési lehetőséget teremt a state-átmenetek okozta, PSI és PSII közötti gerjesztési energia elosztás átrendeződés mérésére, és a távoli vörös fluoreszcenciát mutató kioltó antennakomplexek szerveződési változásának vizsgálatára is.

Klorofill-a fluoreszcencia indukció mérési adatok kiértékelése FluorMeas 1.0 programmal. A bal oldali ablakokban a fluoreszcencia gyors felfutása, míg a középső ablakokban a steady-state állapot kialakulás (fényadaptáció) látható. A jobb oldali ablakok a kinetikát jellemző paramétereket tartalmazzák. A fölső ablakok a diszkrét hullámhosszakon regisztrált adatokat (lila: 735 nm fluoreszcencia, vörös: 690 nm fluoreszcencia), míg az alsó ablakok a két fluoreszcencia arányát (zöld: fluoreszcencia arány) mutatják.

7.7. ábra. Klorofill-a fluoreszcencia indukció mérési adatok kiértékelése FluorMeas 1.0 programmal. A bal oldali ablakokban a fluoreszcencia gyors felfutása, míg a középső ablakokban a steady-state állapot kialakulás (fényadaptáció) látható. A jobb oldali ablakok a kinetikát jellemző paramétereket tartalmazzák. A fölső ablakok a diszkrét hullámhosszakon regisztrált adatokat (lila: 735 nm fluoreszcencia, vörös: 690 nm fluoreszcencia), míg az alsó ablakok a két fluoreszcencia arányát (zöld: fluoreszcencia arány) mutatják.

7.4.1. Mérés FMM fluorométerrel

A készüléket bekapcsolva a PC modul LED-kijelzőjén jelenik meg a menüsor. Válasszuk ki a Measure opciót (1). A mérőmenüben a PLD almenü szolgál a gerjesztő lézerfény kinetikájának beállítására (= Kautsky-kinetika; ≤ gerjesztő kinetika). Állítsuk a műszert Kautsky-kinetika üzemmódba. Csatlakoztassuk a mintatartót a műszer száloptikájához. A mérés a mérőmenü Start (0) funkciójával indítható. Kautsky-kinetika mérése esetén választható, hogy a 690 nm, vagy a 735 nm fluoreszcencia indukciós görbéjét jelenítse-e meg a műszer. Az aktinikus megvilágítás 5 min ideig detektálja az indukált klorofill-fluoreszcenciát. A mérés befejeztével ne felejtsük elmenteni a mérési adatokat, és feljegyezni a mérési fájl nevét! A mérési adatok soros csatlakozón keresztül tölthetők le asztali PC-re. A műszer adatait a FluorMeas for FMM data evaluation 1.0 program kezeli. Értékeljük a vízbontó centrum működését az (I-Fo)/I és (Fp-Fo)/Fp kvantumhatékonyságok összevetésével! Vessük össze a maximális kvantumatékonyságot a Fs;690/Fs;735 arányokkal egy erősen klorotikus és egy egészséges növény esetében!