8. fejezet - Növényi fehérjék vizsgálata poliakrilamid gélelektroforézissel

szerző: Dr. Sárvári Éva

Tartalom

8.1. Elméleti bevezetés
8.1.1. Az elektroforézis alapjai
8.1.2. A poliakrilamid gélek összetétele, struktúrája és előállítása
8.1.3. Mintakészítés a poliakrilamid gélelektroforézishez
8.1.4. A poliakrilamid gélelektroforézis körülményei
8.1.5. Gélelektroforézis módszerek
8.1.6. A proteinek detektálása
8.1.7. A gélek tárolása
8.1.8. Az elválasztott proteinek jellemzése/azonosítása
8.2. PAGE gyakorlatok
8.2.1. A fehérjék elválasztása denaturáló poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS PAGE)
8.2.2. Enzimek elválasztása natív poliakrilamid gélelektroforézissel
8.2.3. Izoelektromos fókuszálás (IEF)
8.2.4. Natív állapotú fehérjekomplexek elválasztása „blue-native” poliakrilamid gélelektroforézissel (BN-PAGE)
8.2.5. Western blotting
8.2.6. Proteinek elektroforézisekor felmerülő gyakori problémák
8.3. Irodalom
8.4. Függelék

8.1. Elméleti bevezetés

Az élő szervezetek, illetve sejtjeik és organellumaik működésének megismerésében fontos szerepet játszik a proteomika (omics – kutatási terület). Célja a teljes protein összetétel megismerése, a proteinek funkcionális szempontból fontos módosításainak (foszforiláció, glikoziláció, acetiláció, degradáció) és kölcsönhatásainak feltárása, illetve a fejlődési, fiziológiai és környezeti változások következtében fellépő fehérje-összetétel és -kölcsönhatás változások nyomon követése. Micro-array technológiával és bioinformatikával kombinálva a vizsgált objektum működése egyre teljesebben tárható fel. Ugyanakkor csak a genomika és a transzkriptomika alapján nem határozható meg a proteom, illetve annak változásai. Eukariótákban a génekben kódolt információ alapján több protein is képződhet (10.000-40.000 gén, >200.000 protein) alternatív start helyek használata, alternatív splicing, poszt-transzlációs módosítás következtében. A transzkriptumok mennyisége sem egyértelmű indikátora a proteomnak, sőt a proteinek aktivitásában bekövetkező számos változás a transzkriptumok mennyiségi változása nélkül, a protein poszt-transzlációs módosításával összefüggésben következik be.

A fehérjeprofil feltárásához az egyes fehérjéket izolálni, majd azonosítani kell. A fehérjék kémiailag inhomogének (oldhatóságban, molekulatömegben és töltésben különbözők, poszt-transzlációsan különbözőképpen módosítottak) és több nagyságrenddel is különböző mennyiségben vannak jelen. Ezért a proteom feltárását nagyban elősegítheti az, ha a fehérjekeveréket előzetesen valamilyen módszerrel frakcionáljuk, s így csökkentjük a továbbiakban együtt vizsgálandó fehérjék számát. Egy fehérjekeverékből a fehérjék legtökéletesebb elválasztása (legjobb felbontás) gélelektroforézissel érhető el.

8.1.1. Az elektroforézis alapjai

Az elektroforézis töltött részecskék elválasztására alkalmas módszer. A változó számú karboxil-, imino-, hidroxil- és amino-csoport pH-tól függő töltést ad a fehérjéknek, kivéve az izoelektromos pontjuknak (pI) megfelelő pH-n, amikor a pozitív és negatív töltések száma megegyezik, azaz a fehérje nettó töltése nulla. Az elektroforézis lényege, hogy potenciál gradiens hatására a töltéssel rendelkező molekulák az ellenkező töltésű pólus felé mozdulnak el v sebességgel (v = E m [cm s-1]). A sebesség a töltéssűrűségüktől, ami meghatározza a mozgékonyságot (m), valamint az alkalmazott elektromos térerősségtől (E) függ. Ha az elválasztandó molekulák egyenletes eloszlásban találhatók az oldatban, akkor E hatására igazi szétválást nem tapasztalunk. Ha azonban a fehérjéket az elektródoktól távol, vékony zónában visszük be a rendszerbe (zonális elektroforézis), akkor az eléggé különböző mobilitású fehérjék szétválnak. A mozgó részecskék vándorlásuk során egymással ütköznek, ami hő termelődését eredményezi. A hőmérséklet emelkedésével nő a diffúzió mértéke, ami keveredést okoz az oldatban és folyamatosan szélesíti az elvált sávokat. Ezért az oldatot általában valamilyen hordozó közeggel stabilizálják. Ezek egyik csoportja inert, azaz az elválasztás szempontjából úgy viselkedik, mint egy oldat, de akadályozza a keveredést és a diffúziót (pl. papír, cellulóz-acetát, szilikagél, cellulóz- és alumínium-vékonyréteg, agaróz gél), az elválasztás tisztán a töltéssűrűség alapján történik. A másik csoport (keményítő- és poliakrilamid gélek) az elválasztási folyamatban is részt vesz azáltal, hogy a hordozó pórusmérete a fehérjék méretével azonos nagyságrendbe esik, ezért molekulaszűrőként viselkedik. Így az elválasztást nemcsak a töltéssűrűség, hanem a molekulatömeg (molecular weight; MW) és az alak is befolyásolja. A keményítőből, lévén biológiai folyamat terméke és különböző szennyeződéseket is tartalmazhat, nem készíthetünk jól reprodukálható géleket és pórusméret-tartománya is limitált. A poliakrilamid gél (PAG) előnye, hogy nagy tisztaságú szintetikus monomerekből polimerizáltatható, kémiailag inert, széles pH (3-10), hőmérsékleti és ionerő tartományban stabil és átlátszó, valamint igen különböző pórusméretű gélek állíthatók elő belőle. Ezért a fehérjék és polipeptidek elválasztására főleg a poliakrilamid gélelektroforézist (PAGE) használják.

8.1.2. A poliakrilamid gélek összetétele, struktúrája és előállítása

A PAG-ek az akrilamid (AA) monomerek és a véletlenszerűen beépülő biszakrilamid (Bis) ko-monomerek polimerizációjával (vinil-polimerizáció) képződnek (8.1. ábra). Ha a géleket a PAGE után fel akarjuk oldani, akkor Bis helyett etiléndiakrilátot (EDIA) használunk, amely lúgos pH-n oldható, vagy N,N’-diallil-tartardiamidot (DATD), amelyet 2%-os perjódsavban lehet feloldani. Ez utóbbi a Bis-tartalmú gélekhez nagyon hasonló struktúrát hoz létre. A szabad gyökök képződését az ammónium-perszulfátból (AP - (NH4)2S2O8) a TEMED (N,N,NN-tetrametil-etiléndiamin) katalizálja, amelyek kiváltják a monomerek polimerizációját. A polimerizációhoz a TEMED szabad bázis formájában szükséges, ezért az alacsony pH késlelteti, vagy megakadályozhatja a polimerizációt (savas tartományban Na2SO3, aszkorbinsav és FeSO4 is használható katalizátorként). A molekuláris oxigén – szabad gyök kioltó – a polimerizációt gátolja, tehát gélöntés előtt az oldatokból a levegőt vízlégszivattyúval el kell távolítani. A polimerizációt a fémszennyeződések is gátolhatják. A polimerizáció mértéke (lánchosszúság, keresztkötések gyakorisága) a monomerek koncentrációján kívül a polimerizáció sebességétől is függ (katalizátorok mennyisége, hőmérséklet). A polimerizáció körülményeit (reagensek tisztasága, koncentrációja, hőmérséklet, O2 eltávolítása) tehát standardizálni kell úgy, hogy a polimerizáció kb. 10-30 perc alatt megtörténjen. A géleket kétszeresen desztillált (ioncserélt) vízzel (bidv), gélpufferrel vagy izo-butanollal (ezt a polimerizáció után pufferre kell cserélni) felülrétegezzük, ami biztosítja a gélek egyenes felszínét, és gátolja az O2 beoldódását.

A poliakrilamid gélek szerkezete. Az akrilamid láncokat biszakrilamid keresztkötések kapcsolják össze. Ez végül is egy háromdimenziós szivacsszerű szerkezet kialakulását eredményezi, amely egy átlagos pórusmérettel jellemezhető.

8.1. ábra. A poliakrilamid gélek szerkezete. Az akrilamid (AA, piros) láncokat biszakrilamid (Bis, kék) keresztkötések kapcsolják össze. Ez végül is egy háromdimenziós szivacsszerű szerkezet kialakulását eredményezi, amely egy átlagos pórusmérettel jellemezhető.

A PAG-ek nagyon oxidatívak, mivel a polimerizáció szabad gyökös katalízise relatíve magas peroxid koncentrációt hoz létre. A peroxid nem töltött, tehát – a perszulfát ionoktól eltérően – elő-elektroforézissel nem távolítható el. Oxidációra érzékeny fehérjeminták esetén ezért a monomerek polimerizációját előidéző szabad gyökforrásként a riboflavin fény hatására történő lebomlásakor keletkező leukoflavint használjuk. A szabadgyök képződéshez a leukoflavin újbóli oxidációja szükséges, aminek feltétele kis mennyiségű O2 jelenléte is. TEMED jelenlétében a polimerizáció megbízhatóbb. A polimerizáció során a fényenergiát (15 W teljesítményű izzó már megfelel) és az időt standardizálni kell.

A gélek pórusméretét, viszkozitását, elaszticitását és mechanikai tulajdonságait az AA és Bis koncentrációja, a polimerizáció foka és a keresztkötések száma határozza meg. Ha az AA/Bis<10, akkor a gél törékeny, merev és átlátszatlan lesz, ha pedig >100, akkor a gél nyúlós és könnyen szétfolyik. Elasztikus és átlátszó géleket kapunk, ha >3%-os AA koncentrációnál az AA/Bis arány ~30. Az elasztikus gélekben az AA koncentráció növekedését a Bis koncentráció csökkenése kell, hogy kísérje: C=6,5-0,3T (5-20%-os géleknél ±1%-os eltérés elfogadható), ahol a C és T a gélek összetételét jellemző adatok, ha V az oldattérfogat:

A PAG-ek pórusmérete függ az AA és a Bis koncentrációtól. Bis hiányában random polimer lánc képződik (viszkózus oldat). Adott Bis koncentrációnál az AA koncentráció növelésével a pórusméret csökken. Adott AA koncentrációnál a Bis koncentráció növelése kb. az össz-monomer 5%-áig csökkenti a pórusméretet (nő a keresztkötések gyakorisága). Nagyobb Bis arány esetén azonban a polimer láncok vastag kötegekbe rendeződnek, amelyek szintén (kisebb számú) keresztkötéssel kapcsolódnak, ezáltal nagy pórusok is nagyobb számban keletkeznek, tehát az effektív pórusméret nő.

A géleket általában két (10-20 cm széles és hosszú) üveglapból és távtartókból álló, leggyakrabban 1 mm vastag kazettába öntjük (8.2. ábra). A mintahelyek kialakításához különböző méretű fésűket használunk. Az öntés végezhető egy-egy gélkazettában külön-külön, illetve több gélt is önthetünk egyszerre öntőkádba helyezett különböző számú kazettában. Lehetőség van kész gélek vásárlására is.

A poliakrilamid gélek előállításához szükséges felszerelés. üveglapok, távtartók, a mintahelyek kialakításához szükséges fésű, gélöntő kád, gradiens keverő.

8.2. ábra. A poliakrilamid gélek előállításához szükséges felszerelés. 1 – üveglapok, 2 – távtartók, 3 – a mintahelyek kialakításához szükséges fésű, 4 – gélöntő kád, 5 – gradiens keverő.

A gradiens gélek öntéséhez gradiens keverő is szükséges. Ez olyan közlekedő edény, amelynek két tartályába lineáris gradiens öntése esetén azonos térfogatú, a gradiens két végpontjának megfelelő gélkeveréket öntünk. A kevertetett edényfélbe a hígabb keverék kerül. Miközben a kevertetett gélkeveréket a függőlegesen álló kazettába juttatjuk, a hiányzó térfogat állandóan pótlódik a másik edényfélből, így a kazettába kerülő keverék folyamatosan töményedik. Az egyre töményebb oldatok egymás alá rétegződve alkotják a gradienst.

8.1.3. Mintakészítés a poliakrilamid gélelektroforézishez

A fehérjék elektroforézishez való előkészítéséhez különböző műveletekre lehet szükség. Ha a mintában az ionerő magasabb, mint a szeparáló gélben, akkor nem jó az elválás, tehát a mintából el kell távolítani a sók nagy részét (dialízis, gélszűrés). Híg oldatok esetén a fehérjetartalmat koncentrálni kell. Ez történhet kicsapással és újraoldással, ami eltávolítja a sókat és a nem dializálható szennyeződést is. Alkalmazhatunk acetonos, alkoholos, ammónium-szulfátos, vagy denaturált proteineknél triklórecetsavas kicsapást is. Koncentrálásra felhasználható még az ultraszűrés, liofilizálás, illetve hidrofil polimerekkel (polietilén-glikol, Sephadex) való beszárítás. Előfordulhat, hogy egyes proteinek olyan nagy mennyiségben vannak jelen, hogy nagymértékben zavarják más proteinek elválasztását, detektálását (albumin a vérszérumban, Rubisco a kloroplasztiszban). Ilyenkor ezeket szelektíven eltávolítják a fehérjekeverékből még a gélelektroforézis előtt. Az oldott DNS növeli a minta viszkozitását, eltömheti a gél pórusait, a proteinekhez kötődve megváltoztatja mobilitásukat. A nukleinsavakat enzimes emésztéssel távolíthatjuk el a mintából.

Mivel a PAGE-sel történő elválasztáshoz a proteineknek oldott állapotban kell lenni, a nem vízoldékony membránfehérjéket a mintakészítés során szolubilizálni kell, a denaturáló PAGE-hez pedig az oldható fehérjéket is denaturálni szükséges. Szolubilizáció/denaturáció céljából különféle anyagokat (detergensek, kaotróp ágensek, redukáló- és alkilálószerek) adhatunk a mintához.

A detergensek erősségüktől függően a hidrofób lipid-protein illetve protein-protein kölcsönhatásokat szüntetik meg, valamint növelik a proteinek oldhatóságát az pI pontjuknál (8.3. ábra). Kettős karakterű vegyületek, amelyek hidrofób és hidrofil molekularészletet is tartalmaznak. Vannak anionos, kationos, iker-ionos és nem-ionos detergensek. Jellegzetességük, hogy egy adott koncentrációjuk, a kritikus micelláris koncentráció (CMC) felett, különböző méretű micellákat alkotnak. A membránfehérjék szolubilizálása azt jelenti, hogy a detergensek szétbontják a membránt, a fehérjéket (lipideket) micellákba zárva elkülönítik, amelyek így már vízoldhatóak és különböző technikákkal elválaszthatók. A leggyakrabban használt és legtökéletesebben szolubilizáló/denaturáló detergens a Na-dodecilszulfát (sodium dodecylsulphate, SDS). A teljes denaturációhoz 4:1 (w/w) SDS/protein arány szükséges. Ilyenkor 1,4 g SDS g-1 protein kötődik, azaz a proteinek felületi töltéssűrűsége azonos lesz (saját töltésük elhanyagolható). A teljes denaturáció az alak azonosságát is jelenti (hidrodinamikai szempontból pálcikaszerű struktúra: a molekulák átmérője hasonló, hosszuk a molekulatömeggel arányos). A detergensek és tulajdonságaik részletesebb leírását ld. a Detergensek fejezetben.

A proteinek szolubilizációja és denaturációja. A membránproteinek és lipidek szolubilizációjához/denaturációjához detergenseket használunk, amelyek a körülményektől függően (a detergens típusa, koncentrációja, hőmérséklet) a membránkomplexeket, illetve a membránfehérjéket oldhatóvá teszik, vagy az utóbbiakat denaturálják. A teljes denaturációhoz a diszulfid-hidakat redukáló ágensek is szükségesek.

8.3. ábra. A proteinek szolubilizációja és denaturációja. A membránproteinek (zöld) és lipidek (kék) szolubilizációjához/denaturációjához detergenseket (piros) használunk, amelyek a körülményektől függően (a detergens típusa, koncentrációja, hőmérséklet) a membránkomplexeket (A,B,C), illetve a membránfehérjéket (1,2,3) oldhatóvá teszik, vagy az utóbbiakat denaturálják. A teljes denaturációhoz a diszulfid-hidakat redukáló ágensek is szükségesek.

A tökéletes denaturációhoz redukáló ágensek, tiol reagensek (diszulfid-hidakat hasítják) is szükségesek. Leggyakrabban a merkaptoetanolt használják. A ditiotreitol, bár drágább, kevésbé erős szagú és nem reoxidálódik. Az intermolekuláris diszulfid-hidak hasításával alegységeket kapunk. Az intramolekuláris diszulfid-hidak hasításával az SDS-kötődés lehet teljesebb, azaz a protein a konformációs különbözőség (a nagyobb mennyiségű SDS tökéletesebben denaturál, nagyobb a felületi töltéssűrűség) miatt gyorsabban fut. A redukáltságot az –SH csoportok jódacetamidos alkilálásával tehetjük irreverzibilissé.

Az oldhatóvá tételt/denaturációt elősegítheti a magas hőmérsékleten való inkubálás, mivel a hőmérséklet emelésével a metastabilis komplexek disszociálnak, illetve kaotróp ágensek alkalmazása is. A kaotróp ágensek a nem-kovalens intermolekuláris kölcsönhatásokat (H-híd kötések, van der Waals kölcsönhatások, hidrofób kölcsönhatások) befolyásolva fejtik ki hatásukat. A denaturáló ágensek is kaotrópok, de a kaotróp ágensek nem mindig denaturálnak! Kaotróp ágensek az urea (6-8 M), tiourea (2 M), guanídium-klorid (6 M), lítiumperklorát (4,5 M). A sók szintén kifejthetnek kaotróp hatást azáltal, hogy árnyékolva a töltéseket destabilizálják az elektrosztatikus kölcsönhatásokat és sóhidakat. A PAGE során leggyakrabban az ureát használják, amely a H-kötések megbontása révén denaturál. A teljes denaturációhoz magas urea koncentráció állandó jelenléte (a gélben is) szükséges. Mivel nem változtatja meg a fehérjék töltését, az elválasztás töltés és méret alapján történik. Bizonyos proteinek (hisztonok, riboszomális- és membránproteinek) urea és SDS jelenlétét is igénylik. Az ureát friss oldatként kell használni, mivel a tárolás során kémiai izomerizációval cianát- ionok képződnek, amelyek a fehérje amino-csoportjaival reagálnak, és így karbamilált proteinszármazékok képződnek. Ennek következtében a protein töltése változik, és ha a reakció nem teljes, akkor egy proteinből több különböző töltésű részecske is képződhet. Trisszel pufferelt oldat, amelynek amino-csoportjai megkötik a cianát-ionokat, és alacsony hőmérséklet (a hőmérséklet emelkedése gyorsítja a cianátképződést) alkalmazása javasolt. A cianát-ionok ioncserélő gyantán való deionizációval távolíthatók el.

A fehérjemintát általában tömörítő gélpufferben oldva visszük fel a PAG-ek mintahelyeire. A minta – a kádpufferrel való keveredést megakadályozandó – glicerint vagy szacharózt is tartalmaz. Mivel a fehérjék színtelenek, a futás előrehaladásának jelzésére a lúgos tartományban 0,001% brómfenolkéket, savasban pedig 0,005% Pyronine Y-t vagy metilénkéket használunk. Ezek a festékek a futás frontvonalát jelzik. A proteolízis gátlása céljából szükséges lehet proteázgátlók alkalmazása is. Szerin típusú proteázok esetében PMSF-t (fenil-metil-szulfonil-fluoridot), Me2+-függőknél o-fenantrolint, cisztein típusúaknál jódacetamidot használhatunk. A proteázok gátlása a minta 1,5-3 perces forralásával is történhet, ha a fehérjék hő hatására nem aggregálódnak. A nem oldódott/aggregálódott proteinek eltávolítása centrifugálással (5-15 min, 10000-20000 g) történik. Ez azért szükséges, hogy ne tömjék el a gél pórusait, ami akadályozza az oldott fehérjék bejutását. A gél mintahelyeire egyféle fehérjéből 1-10 µg-t, fehérjekeverékből 50-100 µg-ot ajánlott felvinni.

8.1.4. A poliakrilamid gélelektroforézis körülményei

A protein gélelektroforézishez általában vertikális gélelektroforézis készüléket (8.4. ábra) használunk (pl. BioRad, Hoefer, Amersham). Ez egy felső és alsó puffertartályból áll, amelyekbe elektródok merülnek. Bázikus pH-n, ahol a fehérjék töltése negatív (a karboxil-csoportok disszociálnak), a felső a katód, az alsó pedig az anód. A két tartály csak a gélen keresztül van elektromos kapcsolatban, amelynek a tetejére rétegezzük a mintát. A töltött részecskék elmozdulásához szükséges térerősség gradienst egy egyenáramú tápegység szolgáltatja. A modern tápegységeken állandó áramerősség, állandó feszültség, ill. speciális esetben állandó teljesítmény is beállítható. A készülékekben az elektroforézis során keletkező hő elvezetését a géleket körülvevő kádpuffer, illetve a gélektroforézis berendezésbe beépített hűtőrendszer is biztosíthatja.

Gélelektroforézis berendezés. A kész gélek egy tartóba kerülnek, amelyet a futtatókád elektródokat hordozó részéhez csatlakoztatunk. A gélelektroforézis során az egyenfeszültséget a tápegység biztosítja.

8.4. ábra. Gélelektroforézis berendezés. A kész gélek egy tartóba (1) kerülnek, amelyet a futtatókád (2) elektródokat hordozó részéhez csatlakoztatunk. A gélelektroforézis során az egyenfeszültséget a tápegység (3) biztosítja.

A PAGE-t számos tényező befolyásolja, amelyeket mindig megfelelően kell megválasztani az adott fehérjék/komplexek mind tökéletesebb elválasztása érdekében. Fontos tényezők az elválasztandó fehérjék/komplexek és a hordozó tulajdonságai. A fehérjék felületi töltéssűrűsége a mozgékonyságot szabja meg, mérete és alakja a gél molekulaszűrő sajátságával összefüggésben fontos. A hordozó pórusmérete szintén a molekulaszűrést befolyásolja, formájától (csőgél/lapgél) a futás reprodukálhatósága függ. A PAGE közegének viszkozitása a mozgékonyságot, pH-ja a töltéssűrűséget, ionereje a hőfejlődést és a sávélességet befolyásolja. Az elektromos térerősségtől a futási idő, az alkalmazott áramerősségtől pedig a hőtermelés függ. A fehérjék elválasztásához általában 10-20 mA cm-2 gélfelület állandó áramerősséget, illetve ~120 V (tömörítés), majd 200 V (szeparálás) állandó feszültséget alkalmazunk.

A PAG-ek molekulaszűrő sajátossága miatt a pórusméretettől függ a felbontás, azaz két szomszédos sáv szétválása. Natív fehérjekeverék esetében 7,5%-os gélekkel érdemes próbálkozni (vagy 5-15%-os AA grádienssel), denaturált fehérjék elválasztására pedig 12%-os gél (vagy 10-25%-os grádiens) a legmegfelelőbb. A két fehérje elválasztására legalkalmasabb módszer (méret vagy töltés alapján történjen-e) kiválasztására, illetve a fehérje tisztaságának és normális futásának az ellenőrzésére a Ferguson-féle analízis révén nyílik lehetőség. Ha a log Rf-t (Rf: a fehérje vándorlása/a jelzőfesték vándorlása) a gélkoncentráció (T%) függvényében ábrázoljuk, akkor a tengelymetszet (Yo) a T=0 esetben (azaz elvileg az oldatban) mérhető mobilitás, a meredekség (KR - retardációs koefficiens) pedig a MW függvénye (8.5. ábra).

Ferguson-féle analízis. Ha ’a’ és ’b’ felületi töltéssűrűsége azonos, méret szerint ’a’<’b’, csak méret szerint választhatók szét. Ha a felületi töltéssűrűség: ’a’>’b’, méret: ’a’<’b’, méret és töltés szerint is szétválaszthatók. Ha a felületi töltéssűrűség: ’a’>’b’, mérete ’a’>’b’, mindkét tulajdonság alapján szétválaszthatók, de nem annál a T%-nál, ahol ugyanolyan a mobilitásuk. Ha a felületi töltéssűrűség: ’a’>’b’, ’a’ és ’b’ mérete azonos, csak töltés szerint választhatók szét.

8.5. ábra. Ferguson-féle analízis. (A) ’a’ és ’b’ fehérje felületi töltéssűrűsége azonos, méret szerint ’a’<’b’, csak méret szerint választhatók szét. (B) felületi töltéssűrűség: ’a’>’b’, méret: ’a’<’b’, méret és töltés szerint is szétválaszthatók. (C) felületi töltéssűrűség: ’a’>’b’, mérete ’a’>’b’, mindkét tulajdonság alapján szétválaszthatók, de nem annál a T%-nál, ahol ugyanolyan a mobilitásuk. (D) felületi töltéssűrűség: ’a’>’b’, ’a’ és ’b’ mérete azonos, csak töltés szerint választhatók szét. Y0 – oldatbeli mobilitás (extrapolált érték), KR – retardációs koefficiens (az egyenes meredeksége).

A fehérje elválasztás kontinuus vagy diszkontinuus PAGE rendszerben történhet. A kontinuitás és diszkontinuitás minden összetevőre vonatkozhat. A kontinuus gélrendszerben a gél egyféle pórusméretű, a pufferek ionösszetétele és pH-ja mindenhol (gélpuffer, kádpuffer) azonos, a pufferek ionereje azonban különbözhet. Általában a mintában a puffer ionereje 1/5-1/10 része a gélpufferének. Ennek koncentráló, sávélesedést kiváltó hatása van az oldatból a szeparáló gélbe való belépéskor, mivel azon túlmenően, hogy az oldatban és a gélben a futási sebesség különböző, ilyenkor a kisebb ionerő miatt még a térerősség gradiens is nagyobb az oldatban. A diszkontinuitás megjelenhet a gél pórusméretében (általában nagy pórusméretű, a mintát tömörítő gélt, és kis pórusméretű, a proteineket szeparáló gélt alkalmaznak), a pufferek összetételében (ionok minősége, koncentrációja, pH). A diszkontinuus rendszereknek a kontinuus rendszerekénél jóval erősebb mintakoncentráló, azaz sávélesítő hatásuk van. A tömörítő gél pH-ját úgy kell megválasztani, hogy a fehérjék mobilitása a pufferben lévő gyorsabban és lassabban futó ion közé essen. Nem alkalmazható ez a rendszer olyan esetben, ha a koncentráló hatás a proteinek aggregációjához, a gélből való kizáródásához vezet. A diszkontinuus rendszer működését a következő példa alapján érthetjük meg (8.6. ábra). Az Ornstein-Davis Trisz-glicin (kádpufferek) - Trisz-HCl (gélpufferek) rendszerben a tömörítő gél pH-ját úgy választják meg, hogy az közel legyen a glicin (gyenge sav) disszociációs állandójához, így az csak gyengén disszociál. Ilyenkor v = E mx (x a disszociált molekulák aránya). A klorid mobilitása jóval nagyobb lévén (leading ion) a térerősség gradiens hatására elfut a glicináttól (trailing ion) egy kis konduktivitású zónát hagyva maga mögött. Az így kialakuló nagyobb térerősség gradiens felgyorsítja a glicinát ionok futását úgy, hogy azok közvetlenül a klorid után futnak, köztük éles határfelülettel. A proteineket a klorid gyorsan elhagyja, így azok futása is felgyorsul a kis konduktivitású közegben. Végül is a proteinek egy szűk (néhány µ vastagságú) zónában, a mobilitásuk sorrendjében futnak a klorid és a glicinát ionok közti határfelületen. (isotachophoresis). A proteinsáv vastagsága nem a minta protein koncentrációjától, hanem a gélre felvitt protein mennyiségétől függ. A szeparáló gél pH-ján már a glicin is jól disszociál, ilyenkor mind a klorid, mind a glicinát ionok mobilitása nagyobb lesz a proteinekénél, így a proteinek előtt futnak egy ion-határfelületet képezve. A fehérjék az egyenletes térerősség gradiens hatására mozognak a gélben. Mozgási sebességüket a gél molekulaszűrő hatása erősen befolyásolja, így szétválnak.

A diszkontinuus gélrendszer működése. Ha a felvihető mintatérfogat viszonylag nagy, a mintát a tömörítő gél pufferében visszük fel. A tömörítő gélben kialakuló nagy térerősség gradiens hatására a fehérjék a pufferek negatívan töltött ionjai közé rendeződve néhány µm vastagságú sávban érik el a szeparáló gél tetejét. A szeparáló gélen az ionok gyorsan mozogva elhagyják a fehérjéket egy ion-határfelületet képezve, a fehérjék mobilitásuk szerint szétválnak.

8.6. ábra. A diszkontinuus gélrendszer működése. (A) A felvihető mintatérfogat viszonylag nagy, a mintát a tömörítő gél pufferében visszük fel. (B) A tömörítő gélben kialakuló nagy térerősség gradiens hatására a fehérjék a pufferek negatívan töltött ionjai közé rendeződve néhány µm vastagságú sávban érik el a szeparáló gél tetejét. (C) A szeparáló gélen az ionok gyorsan mozogva elhagyják a fehérjéket egy ion-határfelületet képezve, a fehérjék mobilitásuk szerint szétválnak.

A PAGE történhet disszociáló és nem disszociáló körülmények közt. A natív proteineket általában nem disszociáló körülmények közt futtatjuk. Ilyenkor a natív protein konformáció és a biológiai aktivitás, illetve a többkomponensű komplexekben az alegység-kölcsönhatások megmaradnak a PAGE során is. Az elválasztás általában méret és töltés szerint történik. A leggyakrabban használt rendszerek a Trisz-glicin (Laemmli-féle, pH=8,3-9,5) és a Trisz-borát (Neville-féle, pH=8,3-9,3). Ha a fehérjék natív állapotának fenntartásához redukáló ágens is szükséges, akkor 1 mM ditiotreitolt teszünk a gélbe (a merkaptoetanol 10 mM koncentrációban effektív, ez azonban gátolja a polimerizációt, ezért nem alkalmazható). Másik lehetőség töltött tiol-reagensek (1 mM tioglikolát vagy 10 mM 3-merkaptopropionsav) hozzáadása a felső pufferhez. Gyenge detergenseket is használhatunk nem denaturáló körülmények közt. Ha nem szükséges a natív állapot fenntartása, hanem a fehérjék jobb elválasztása a cél, akkor disszociáló körülmények közt végezzük az elektroforézist. Általában erős detergenst (SDS) és redukálószereket, esetleg magas hőmérsékletet, kaotróp ágenseket is alkalmazunk a minta teljes szolubilizációja/denaturációja céljából.

A pufferek pH-ja elvileg bármilyen lehet. Natív PAGE esetén azonban kritikus, mivel a protein saját töltése pH-függő. Minél távolabb van a pH a pI-tól, annál nagyobb a töltés, azaz a szeparáció sebessége, tehát kisebb a sávkiszélesedés. Minél közelebb van az pI-hoz, annál nagyobb a proteinek közti töltéskülönbség és így ez is növelheti két fehérje elválását. Sok protein pI-ja pH 4-7 között van, ezért többnyire pH 8,0-9,5 PAGE rendszereket alkalmaznak. Fontos lehet a pH a protein stabilitása és biológiai aktivitásának megmaradása szempontjából is, mivel extrémebb pH-knál protein hidrolízis (deamidáció) léphet fel. Diszkontinuus rendszerben a koncentráló hatás miatt lehet kritikus a tömörítő gél pH-ja. Disszociáló rendszerekben a pH nem annyira kritikus, mivel az SDS-t kötő proteinek széles pH-tartományban negatívan töltöttek.

8.1.5. Gélelektroforézis módszerek

Megkülönböztetünk analitikai és preparatív PAGE módszereket. Az analitikai módszereket, amelyek célja a fehérjék elválasztása és jellemzése/azonosítása, gyakrabban alkalmazzák. Néha azonban nagyobb mennyiségű tiszta fehérje előállítására preparatív PAGE-t is használnak. Mivel ehhez nagyobb méretű gélekre van szükség, ilyenkor az elektroforézis közbeni melegedés megakadályozására nagyobb gondot kell fordítani.

Az elválasztás elve alapján megkülönböztethetünk natív PAGE-t, ahol a proteinek elválasztását a méret, a töltéssűrűség és az alak is befolyásolja, izoelektromos fókuszálást, ahol az elválasztás az aminosav összetételtől függő töltéskülönbség alapján történik, és SDS PAGE-t, amikor a fehérjék molekulatömege az elválasztást meghatározó paraméter.

A natív PAGE olyan körülmények közt történik, amikor a fehérje a gélelektroforézis alatt is natív állapotban marad, alegységszerkezetét, funkcióját megtartja. Sokféle változata lehet. Egyik speciális esete a „Blue-Native” (BN) PAGE, amely 100-1000 kDa mérettartományba eső strukturális vagy funkcionális szuperkomplexek natív állapotban történő elválasztására alkalmas. E módszerrel tehát vizsgálható a komplexek közötti kölcsönhatás (interaktom) is. Az elektroforézis előtt a mintákat csak gyenge detergensekkel kell szolubilizálni, amelyek a lipid-fehérje kölcsönhatásokat anélkül bontják meg, hogy a fehérjék/komplexek natív komplexstruktúrájában kárt tennének. Leggyakrabban n-dodecil-β-D-maltozidot vagy digitonint használnak. Az elektroforézishez szükséges negatív töltéseket a detergensek helyett a mintához adott „Coomassie Brilliant Blue” (CBB) festék biztosítja.

Az SDS PAGE során a fehérjéket teljes mértékben denaturáljuk. A nem vízoldékony fehérjéket erős detergens (SDS) alkalmazásával oldhatóvá tesszük. (Az SDS a gélben és a tartálypufferekben is jelen van, hogy a fehérje a PAGE során is denaturált/oldható maradjon.). A vízoldékony fehérjékhez is SDS-t kötünk. A nagymértékű SDS kötődés miatt minden fehérje jelentős negatív töltést nyer, ami mellett saját töltése nem lényeges, felületi töltéssűrűségük azonos lesz. A fehérje harmadlagos/negyedleges szerkezetét reduktánsok, alkilálás, kaotróp ágensek alkalmazásával megszüntetjük, így hidrodinamikai szempontból alakjuk is azonos lesz. A gélek pórusmérete a molekulamérettel összemérhető, így a teljesen denaturált fehérjék a PAGE során MW-ok szerint válnak el. Az ettől eltérő, anomális viselkedés Fergusson-féle analízissel állapítható meg (az Yo különböző, ha a specifikus SDS kötés nem azonos).

A natív és SDS PAGE egy speciális esete a gradiens PAGE, amikor a gél pórusmérete a molekulák mozgási irányában csökken, tehát a molekulák mindig egy nagyobb pórusú gélből egy kisebb pórusúba lépnek be, ami állandó sávélesedést eredményez. Egy idő után elérik a nagyságuk által meghatározott pórushatárt, és nem képesek tovább vándorolni. A náluk kisebb molekulák azonban igen. Így a kisebb felületi töltéssűrűségű, de kisebb molekulák távolabbra juthatnak a gélen. A fentiekből következően a homogén pórusméretű géleknél jobb felbontást eredményez mind natív, mind denaturáló körülmények közt. Konkáv gradiens gélek a nagy, a lineáris gradiensek a kis MW tartományban szeparálnak jobban. A gradiens gélek mintegy 100 fehérje sáv felbontására alkalmasak. A gradiens PAGE széles MW tartományban biztosít jobb elválást, ugyanakkor kevéssé különböző MW-ű fehérjék jól megválasztott homogén gélen választhatók el tökéletesebben.

Izoelektromos fókuszálás (IEF) esetén az elválasztás nagy pórusméretű hordozón (agaróz, nagy pórusú PAG) történik, amfolitok jelenlétében. Az amfolitok amfipatikus, iker-ionos poliamino-polikarbonsavak elegyei, amelyeket akrilsav és különböző polietilének, poliaminok szintézisével állítják elő. Vízoldékony, jó pufferkapacitású, jó vezetőképességű, a fehérjékhez képest kis molekulatömegű (~5 kDa), UV-ban alacsony abszorbanciájú molekulák. Stabil pH gradiens előállítására alkalmasak. A pH gradiens előállítása úgy történik, hogy elektromos áramot bocsátunk az adott pH tartománynak megfelelő, egymástól kevéssé különböző pI-tal rendelkező amfolitokat tartalmazó oldatba. Kezdetben, a közegben a pH egységes és megfelel az amfolitok átlagos pH értékének. Elektromos tér hatására a legnegatívabb, legkisebb pI-ú, legsavasabb amfolit az anód felé mozog addig, míg a nettó töltése 0 lesz. A kevésbé savas amfolitok rendre az anódtól távolabb érik el a 0 nettó töltést. Hasonló a helyzet a pozitív töltésű, bázikusabb amfolitokkal, amelyek a katód felé mozognak. A pH-gradiens felépülését a vezetőképesség, illetve az áramerősség változásának, csökkenésének mérésével lehet nyomon követni. Az egyensúly beállta jelzi a folyamat végét. A pH-gradiens gyorsabb kialakítása érdekében a feszültséget lépcsőzetesen emelik (200-400-800 mV). Manapság inkább kész strip-eket használnak, amelyek immobilizált pH gradienseket tartalmaznak. Széles (pH 2.5-13) és szűkebb (pl. 4-6, 6-8, 9-11) pH tartományt képviselve kerülnek forgalomba. Kaphatók nem-lineáris pH-gradienst tartalmazó gélek is, amelyek elválasztási hatékonysága a gradiens közepén a legjobb és a gradiens szélei felé logaritmikusan csökken.

Az IEF során a fehérje elválasztás elve az, hogy ha egy fehérjeelegyet elektromos feszültség hatására egy lineális pH-gradiens mentén mozgatunk, akkor minden egyes fehérje azon pH-jú térrészig mozog, ami megegyezik a pI értékével. Mivel itt már töltéssel nem rendelkezik, így az elektromos erőtér nem hat rá, megáll. Amikor a pI-ot elérő fehérje a diffúziós mozgása miatt akár a katód, akár az anód felé elmozdul, ismét töltötté válik és az elektromos erőtér visszakényszeríti az izoelektromos pontjára. Így az azonos pI-ú fehérjék, amelyek IzoElektromosak, mérettől, tömegtől és alaktól függetlenül éles sávot alkotva válnak el (Fókuszálás). Az elválasztás feloldása az alkalmazott pH-gradiens léptékétől függ és igen nagy pontosságú is lehet (0,01-0,02 pH egység). A fehérjék pI-je általában 3-12, leggyakrabban 4-7 pH-jú tartományba esik. Az IEF során a fehérjék oldatban tartását alapvetően nem-ionos, illetve iker-ionos detergensekkel (Triton X-sorozat, CHAPS, Nonidet P40, Zwittergent, TWEEN 20, oktil-glükozid, 1-2%-os koncentrációban) érik el. Denaturáló ágensként általában ureát (4-9 M) alkalmaznak. A gélen történő elválasztásnál fontos szempont, hogy a hordozó pórusmérete megfelelően nagy legyen, ne akadályozza a fehérjék szabad mozgását. Egyes esetekben a nagyobb pórusméret miatt indokolt lehet agaróz alkalmazása. A gél, illetve a pH-gradiens stabilizálása céljából 10-12% glükózt, szorbitolt, szacharózt is adhatnak a géloldathoz.

Számos egyéb speciális PAGE módszer is ismeretes. A kis molekulatömegű komponensek (1000-10000 Da) pl. jobban elválnak, ha a gélbe ureát is teszünk, vagy speciális puffereket (pl. Trisz-glicin helyett Trisz-tricint) használunk.

Gyakran alkalmaznak egymásra épülő 2 dimenziós (2D) és 3D (pl. BN/BN/SDS PAGE, BN/IEF/SDS PAGE) módszereket is. A legáltalánosabban használt, legjobb felbontású 2D PAGE módszer az IEF/SDS PAGE, amely az 1.D-ban pI, a 2.D-ban méret szerint választ el (8.7A. ábra). Kimutatási módszertől függően (Coomassie-, Ag- festés, illetve autoradiográfia) 400-2000 protein detektálható. Hátránya, hogy az IEF-t megelőző delipidálást követően a hidrofób proteinek nem vagy kevéssé oldhatók vissza, tehát membránproteinek kvantitatív vizsgálatára nem alkalmas. Azt kiküszöbölendő, hogy a sok protein folt miatt a kiértékelés és más mintákkal való összehasonlítás nehéz, kidolgozták a differenciál gél elektroforézis (DIGE) módszert (8.7B. ábra).

Fehérjék elválasztása IEF/SDS PAGE 2D rendszerekben. Tilakoidmembrán-fehérjék elválása hagyományos rendszerben: A fehérjék fókuszálása pH 4-7 lineáris gradiens strip-en történt. A szélsőértékeknél kisebb/nagyobb pI-vel rendelkező fehérjék az elektród mellett gyűltek össze, és futottak a 2.D-ban. Az antenna- (LHC-) fehérjék mind izoelektromos pontjaik, mint tömegük különbözőségei alapján jó elválást mutatnak. Patkány agy szolubilis fehérjéinek elválasztása DIGE IEF/SDS PAGE módszerrel. A DIGE gél három különböző festékkel (Cy2, Cy3, Cy5) előre festett három különböző mintát tartalmaz, amely festékeket a saját gerjesztési hullámhosszukon emittáló lézerrel szkennelve az egyes minták foltmintázata külön-külön digitalizálható. Az így nyert foltmintázatokat egymásra helyezve a mintákban eltérő mennyiségben jelen lévő proteinek a saját festékük színével jelennek meg, míg a minden mintában jelen lévő proteinek fehér színnel láthatók.

8.7. ábra. Fehérjék elválasztása IEF/SDS PAGE 2D rendszerekben. (A) Tilakoidmembrán-fehérjék elválása hagyományos rendszerben: A fehérjék fókuszálása pH 4-7 lineáris gradiens strip-en történt. A szélsőértékeknél kisebb/nagyobb pI-vel rendelkező fehérjék az elektród mellett gyűltek össze, és futottak a 2.D-ban. Az antenna- (LHC-) fehérjék mind izoelektromos pontjaik, mint tömegük különbözőségei alapján jó elválást mutatnak. (B) patkány agy szolubilis fehérjéinek elválasztása DIGE IEF/SDS PAGE módszerrel. A DIGE gél három különböző festékkel (Cy2, Cy3, Cy5) előre festett három különböző mintát tartalmaz, amely festékeket a saját gerjesztési hullámhosszukon emittáló lézerrel szkennelve az egyes minták foltmintázata külön-külön digitalizálható. Az így nyert foltmintázatokat egymásra helyezve a mintákban eltérő mennyiségben jelen lévő proteinek a saját festékük színével jelennek meg (bekeretezett foltok), míg a minden mintában jelen lévő proteinek fehér színnel láthatók.

A BN/SDS PAGE módszer membránproteinek kvantitatív vizsgálatára is alkalmas. A natív állapotban szétválasztott (BN PAGE az 1.D-ban) protein-komplexeket a második dimenzióban denaturáló SDS PAGE-t alkalmazva protein összetevőikre bonthatjuk (8.8A. ábra). Ez az IEF/SDS PAGE alternatívája membrán proteinek esetében. 3 dimenzióssá is tehetjük, ha a 2.D-ban is natív PAGE-t alkalmazunk, amivel a protein komplexeket alkomplexeikre bontjuk, és ezután alkalmazzuk az SDS PAGE-t.

A fentieken kívül még számos 2D PAGE technika létezik, amelyek alapja az, hogy az 1. és 2. dimenzióban különböző gélrendszereket alkalmazunk. Egy érdekes alkalmazás a metal affinity shift” módszer, ami azon az elven alapul, hogy a fémion kötődés megváltoztatja a protein töltését és konformációját, tehát a fémet kötő, illetve nem kötő protein mobilitása különböző még az SDS PAGE körülményei közt is. Ha tehát az egyik dimenzióban divalens kationok, a másik dimenzióban egy erős kelátor (pl. EDTA, EGTA) van jelen a gélben, akkor a fémet nem kötő, mobilitásukat nem változtató, azaz a 2. dimenzióban átlósan futó proteinektől eltérően a fémkötő proteinek foltjai kiválnak a diagonálisból. Hasonlóan mobilitást változtatnak (kiválnak a diagonálisból), tehát elválaszthatók a szolubilis proteinektől a hidrofób proteinek, ha a két dimenzióban változtatjuk az akrilamid koncentrációt, a gél urea tartalmát és/vagy a trailing iont (8.8B. ábra). E módszerekkel egy komplex proteinkeverékből elválaszthatók a fémiont kötő vagy hidrofób proteinek.

Membránfehérjék elválasztása 2D gélrendszerekben. Tilakoidmembrán-fehérjék elválasztása BN/SDS PAGE-sel. A hidrofil és hidrofób mitokondrium proteinek szétválasztása különböző AA koncentrációt alkalmazó Trisz-Tricin SDS/SDS PAGE-sel.

8.8. ábra. Membránfehérjék elválasztása 2D gélrendszerekben. (A) Tilakoidmembrán-fehérjék elválasztása BN/SDS PAGE sel. A piros keret a fénygyűjtő komplexek 20-29 kDa-os proteinjeit mutatja a tilakoid-komplexekben. (B) A hidrofil és hidrofób mitokondrium proteinek szétválasztása különböző AA koncentrációt alkalmazó Trisz-Tricin SDS/SDS PAGE-sel. Az ND a NADH dehidrogenáz komplex, a Cox a citokróm oxidáz komplex fehérjekomponenseit jelöli a mitokondriumokból származó mintában (Rais és mtsai, 2004 – engedéllyel reprodukálva).

8.1.6. A proteinek detektálása

A detektálási módszer kiválasztását befolyásolják, az érdeklődésünkre számot tartó protein tulajdonságai, mennyisége, illetve a módszer érzékenysége, a festési módszer lineáris tartománya, és nem utolsósorban anyagi lehetőségeink, valamint a rendelkezésre álló képalkotó berendezés igényei.

A proteineket az aromás aminosavak (Trp, Tyr) UV elnyelése alapján festés nélkül is detektálhatnánk, de mivel a fehérjék extinkciós koefficiense kicsi, és a szennyeződések – a monomerek és az SDS – szintén elnyelnek, csak nagymennyiségű fehérje lenne detektálható nagyon tiszta reagensekből készített gélekben. Ezért a protein sávokat/foltokat festve, illetve egyéb jelölések után detektálják. A detektálási technika a jelölés módjától függ. A festett géleket szkennelhetjük vagy fényképezhetjük (abszorbancia alapján), a fluoreszkáló ágensekkel jelölt fehérjék fluoreszcens detektorral, a radioaktívan jelölt fehérjék pedig autoradiográfiával mutathatók ki.

A festés előtt a diffúzió megakadályozása céljából fixálni kell a proteineket és el kell távolítani azokat az anyagokat, amelyek zavarhatják a procedúrát (SDS, redukáló ágens, glicin, amfolit). Ionmentes vizet és üvegedényeket kell használni. Figyelembe kell venni, hogy a proteinek a különböző festési eljárásokkal különböző mértékben/intenzitással festődnek, tehát a proteinek minél teljesebb kimutatásához néha egymás után kétféle technikát is alkalmaznak.

Legáltalánosabb a CBB R250 és G250 (vörös és zöld árnyalatú) festékek használata, mivel ezek a proteinek széles spektrumával reagálnak. (Régebben e festékeket a gyapjú festésére használták.) Savas/alkoholos közegben az -NH3+ csoportokkal és hidrofób oldalláncokkal lépnek kölcsönhatásba. A savas közeg fixálja a proteineket és elősegíti a festékkötést. A festéktelenítés diffúzióval vagy a gél vastagsága irányában végzett elektroforézissel történhet. A CBB festékek abszorpciós maximuma 560-575 nm közt van, 40 ng protein a detektálhatóság határa. Hátrányai, hogy erős a háttérfestődés, munkaigényes, DNS, lipopoliszaharidok és poliszaharidok is festődhetnek. A kolloidális CBB G-250 festéket alkalmazó procedúrákban a festés érzékenysége 10 ng, megközelíti az ezüst-festését (blue silver), és a háttérfestődés elhanyagolható.

Az ezüst-festés során Ag+ ionok (AgNO3) savas közegben a proteinek töltött oldalláncaihoz kapcsolódnak, amelyeket azután a formaldehid lúgos pH-n Ag-té redukál (az oldat savanyításával leállítható). Az Ag fehérjékhez való kötődését oxidálószerek (K-permanganát/dikromát, ferricianid) elősegíthetik. 2D gélek esetében a második dimenzió festésénél gyakran használják. Vannak a módszernek színes változatai, amikor a különböző fehérjék különböző színűre festődnek.

A fluoreszcens jelölés lényege, hogy fluoreszkáló anyagot (danzil-klorid, fluoreszcein, MDPF – 2-metoxi-2,4-difenil-3(2H)-furanon) kötnek kovalensen a proteinekre, ami UV megvilágítás hatására a látható tartományban fluoreszkál. Detektálása és a mennyiségi meghatározás azonban speciális műszert igényel, és a reagensek fluoreszcenciája hamar megszűnhet. Újabban új, fluoreszcens festékeket állítottak elő, amelyek stabil fluoreszcenciával rendelkeznek. Pl. a SYPRO Ruby érzékenysége 1-10 ng és széles koncentrációtartományban lineáris a fluoreszcens jel, nem festi a nukleinsavakat, de kimutatja a gliko- és lipoproteineket, kis MW-ú és fémkötő proteineket is, amelyek nem jól festődnek más festékekkel.

A láthatóvá tett proteinek mennyiségi kiértékeléséhez a géleket szkenneljük/fényképezzük és a sávok/foltok denzitását határozzuk meg (denzitogram). Erre a célra megfelel egy jó optikai felbontású szkenner, de speciális, kalibrálható, pixeldenzitást vagy fluoreszcenciát detektáló berendezések is kaphatók. A kiértékeléshez speciális szoftverek vásárolhatók. A proteineket automata pipettavégekkel, illetve szofisztikált, erre a célra kifejlesztett berendezésekkel vághatjuk ki a gélekből (pontos foltkivágás, microplate-re helyezés).

Az autoradiográfiás detektálás során radioaktívan jelölik a proteint, ami történhet a szintézis során, vagy radioaktív anyagokkal való kezeléssel, úgymint 3H- vagy 14C-danzill-klorid vagy 14C-, 35S-fenilizocianát rákötésével, 3H- vagy 14C-jódacetamiddal történő alkilálással, 3H- vagy 14C-formaldehiddel történő reduktív metilációval vagy a Tyr jodinációjával (125I). A detektálás során a szárított gélt Röntgen-filmre helyezve a sugárzás hatására az AgCl-ból Ag válik ki, a feketedés fotózható, denzitometrálható. Ha oldható gélekkel dolgoztunk, a géleket szeletelés után feloldjuk, és szcintillációs számlálóval mérjük a radioaktivitást.

Glikozilált proteinek (glikoproteinek) kimutatására fukszin-alapú Schiff- (PAS-) festés a legelterjedtebb módszer, a legérzékenyebb módszerek közé azonban olyan kimutatások tartoznak, mint a timol-szulfáton, vagy az akár 40 ng szénhidrátot is kimutatni képes danzil-hidrazinon alapuló festés. A lektinek speciális, szénhidráthoz kötődő fehérjék. Izotóppal, fluoreszcens festékkel jelölt vagy enzim-konjugált lektinekkel ugyancsak detektálhatók a glikoproteinek a gélekben.

Foszforilált proteinek kimutatására nukleinsavaktól tökéletesen megtisztított minta esetében van lehetőség. A kimutatásra fel lehet használni in vivo izotóppal jelölt mintákat, hiszen a 32P a fehérjékbe csak foszforilációval épül be. A nem-radioaktív kimutatási technikák közül legérzékenyebb az alkalikus hidrolízissel szabaddá váló foszfátcsoport oldhatatlan kalcium-foszfáttá történő alakítása, és ammónium-molibdát és metilzöld festék segítségével történő kimutatása (foszfomolibdát képződik). A módszer kimutatási határa 1 nmol foszfát körül mozog. Rodamin-β-foszfomolibdát kialakításával a kimutathatóság határa 2-3-szorosára növekszik.

A lipoproteinek detektálása történhet elektroforézis utáni kimutatással (pl. Schiff-festés alapú módszerek), illetve futtatás előtti festési módszerekkel (pl. nitroblue tetrazólium: NBT, acetilált Sudan black B), melyek ideális esetben nem, vagy csak kevéssé zavarják az elektroforézist.

Enzimek aktivitásfestése gélekben leggyakrabban in situ színreakcióval történik (8.9. ábra). A módszerek szemi-kvantitatívak, és viszonylag kevés enzim festésére jól kidolgozottak. Használatukkal azonban lehetővé válik egy adott enzimreakciót mutató fehérjesáv kimutatása más fehérjék jelenlétében. Az enzimfehérjéket, aktivitásuk megőrzése érdekében, csak natív körülmények között választhatjuk el, ami csökkenti az elválasztás hatékonyságát, bár ismert néhány példa, pl. humán hasnyálmirigy enzimek közül, amikor az enzimek SDS-PAGE elválasztás után is jó enzimaktivitást produkálnak.

Enzimfehérjék aktivitásának kimutatása in situ aktivitásfestéssel. A peroxidáz izoformák hidrogén-peroxid jelenlétében aromás monomereket oxidálnak színes végtermékké. A szuperodid diszmutáz izoformák hidrogén-peroxidot bontanak, így aktivitásuk helyén a gél nem színeződik el (negatív festés).

8.9. ábra. Enzimfehérjék aktivitásának kimutatása in situ aktivitásfestéssel. (A) A peroxidáz izoformák hidrogén-peroxid jelenlétében aromás monomereket oxidálnak színes végtermékké. (B) A szuperodid diszmutáz izoformák hidrogén-peroxidot bontanak, így aktivitásuk helyén a gél nem színeződik el (negatív festés).

Redoxreakciókban tetrazólium sókat (NBT; metil-tiazolil-tetrazólium: MTT) lehet használni a kimutatáshoz, melyek végső elektron-akceptorként redukálódva színes végterméket eredményeznek. Peroxidáz enzimreakciók kinonos és benzidin jellegű szubsztrátokkal mutathatók ki (8.9.A és 8.10. ábra). Az enzimreakció gélben történő kimutatásához a szubsztrátnak be kell jutnia a gélbe, valamint a keletkező színes, vagy fluoreszcenciára képes terméknek nem, vagy csak kis mértékben szabad a gélben diffundálni. Minden enzimreakció pH optimummal rendelkezik, amelyet a gél megfelelő pH-jú pufferben történő inkubálásával tudunk elérni. Ritkán használt módszer a szubsztrátok poliakrilamid gélbe történő szilárdítása a gélelektroforézist megelőzően.

Peroxidáz enzimreakció kimutatása poliakrilamid gélben. A szubsztrátként felhasznált benzidin-vegyület a peroxidáz enzim aktivitása következtében hidrogén-peroxid jelenlétében polimerizál, majd egy következő enzimatikus lépésben oxidatíve ciklizálódik, így oldhatatlan, gélben maradó színes végtermék keletkezik.

8.10. ábra. Peroxidáz enzimreakció kimutatása poliakrilamid gélben. A szubsztrátként felhasznált benzidin-vegyület a peroxidáz enzim aktivitása következtében hidrogén-peroxid jelenlétében polimerizál, majd egy következő enzimatikus lépésben oxidatíve ciklizálódik, így oldhatatlan, gélben maradó színes végtermék keletkezik.

8.1.7. A gélek tárolása

A géleket tárolhatjuk is. A tárolás történhet nedvesen (a tároló oldatban, tasakba hegesztve), illetve szárítás után. A szárítás előtt a géleket egy éjszaka 5-szörös térfogatú 1% (v/v) glicerint és 10% (v/v) ecetsavat vagy 30% (v/v) metanolt és 3% (v/v) glicerint tartalmazó oldatban áztatjuk a szárítás közbeni törés megakadályozására. Ezután szűrőpapírra helyezve, melegítős szárítóban vagy egy keret felhasználásával, a fenti oldattal megnedvesített cellofán lapok közé feszítve levegőn szárítjuk.

8.1.8. Az elválasztott proteinek jellemzése/azonosítása

A legegyszerűbb jellemző a MW, amely a teljesen denaturált fehérjék SDS PAGE-sel történő elválasztásakor határozható meg. A MW-et általában dalton (Da), illetve inkább kDa egységekben fejezik ki. 1 Da a 12C (6 proton + 6 neutron) tömegének 1/12-ed része. Denaturáló körülmények közt elválasztott fehérjék MW-ét azonos körülmények közt futtatott standard fehérjék MW-e alapján készített kalibrációs görbe segítségével határozzuk meg: a Rf – a jelzőfestékhez viszonyított mobilitás – függvényében ábrázolva log MW-et a géltől függően különböző MW tartományban egyenest kapunk. 5%-os gélben kb. 60-200 kDa, 10%-osban 15-70 kDa, 15%-osban 12-45 kDa-os tartományban egyenes a kalibrációs görbe. A MW meghatározás akkor reális, ha az SDS kötés nem anomális. (Anomália: pl. a glikoproteineknél, amikor csak a protein része köt megfelelő mennyiségű SDS-t, tehát a csökkent felületi töltéssűrűség miatt a MW nagyobbnak adódik.) Növekvő T%-os géleken futtatva a mérettől függő szűrőhatás egyre inkább előtérbe kerül és így a látszólagos MW egyre jobban közelít a valódihoz.) Gradiens gélekben a log T% (lineáris gradiensen log Rf) és a log MW között van lineáris összefüggés. 7-25%-os (C=1%) gélekben a 14-330 kDa, 5-20%-osban (C=2,6%) 14-210 kDa, 3-30%-osban (C=8,4%) 13-950 kDa-os tartományban egyenes a kalibrációs görbe. A gradiens géleken tehát a kalibrációs görbe szélesebb MW tartományban lineáris, mint a homogén pórusméretű géleken. A standard protein keverékek különböző MW tartományban állnak rendelkezésre. Előre festett standard proteinek is kaphatók, amelyek a western blot-nál (ld. lejjebb) jól használhatók.

Információt nyerhetünk a proteinekről peptidtérképezés (peptid mapping) segítségével is. Ezzel a módszerrel eldönthetjük, hogy két minta ugyanolyan mobilitású sávjában futó proteinek azonosak-e, illetve ugyanazon mintában a különböző helyen futó proteinek közt van-e hasonlóság (prekurzor-produktum vagy oligomer-monomer kapcsolat). E kérdések eldöntésére a proteinekből specifikus peptid fragmentumokat állítanak elő. Specifikusak abból a szempontból, hogy adott aminosavak közt történik a hasítás, és a peptid fragmentumok nem túl kicsik. A fragmentálás különböző kémiai vagy enzimatikus módszerekkel történhet. Bármely módszer, ami specifikusan hasítja a fehérjét, alkalmas erre a célra, mint a proteázok alkalmazása, savas hidrolízis (Asp-Pro), hidroxilaminos vágás (Asn-Gly), cianogén-bromiddal történő hasítás (Met). A peptidek azonosítása történhet MW meghatározással (SDS-PAGE), immunológiailag (western blotting, ld. lent), illetve aminosav szekvencia alapján (Edman-degradáció, tömegspektrográfia, ld. később).

Egyes fehérjék azonosítására használhatunk immunológiai módszereket (western blotting). A blottolás során az elválasztott fehérjét egy vékony hordozóra transzferáljuk, amelynek a felületén a proteinek hidrofób és elektrosztatikus kölcsönhatásokkal kötődnek (8.11. ábra).

Western blotting. A fehérjéket a gélből a hordozó felületére visszük át elektroforézissel (transzfer), majd a hordozó fehérjét nem kötő részeit fehérjeszerű anyaggal fedjük le (blokkolás). A vizsgálni kívánt fehérjét specifikus antitesttel reagáltatjuk. A specifikus antitest-fehérje komplexhez a specifikus antitesthez kötődő második antitestet kötünk, amely egy enzimet köt. Az enzimreakció termékét színes végterméket adó reakcióval mutatjuk ki.

8.11. ábra. Western blotting. (A) A fehérjéket a gélből a hordozó felületére visszük át elektroforézissel (transzfer), majd a hordozó fehérjét nem kötő részeit fehérjeszerű anyaggal fedjük le (blokkolás). A vizsgálni kívánt fehérjét specifikus antitesttel reagáltatjuk. (B) A specifikus antitest-fehérje komplexhez a specifikus antitesthez kötődő második antitestet kötünk, amely egy enzimet köt. (C) Az enzimreakció termékét színes végterméket adó reakcióval mutatjuk ki.

A hordozó lehet nitrocellulóz membrán (általában 0,45 µm pórusméretűt használnak, de kis proteineknél a 0,22 µm-es a jobb), illetve nylon membrán (erősebb, nagyobb proteinkötő kapacitású, de immunológiai detektálásnál vagy festésnél az erősebb kötőképesség miatt nagyobb nem specifikus antitestkötés, illetve sötétebb háttér figyelhető meg). A blottolás félszáraz és nedves rendszerben is végezhető. A félszáraz rendszer kevésbé effektív nagy molekulák esetében. A transzfer hatékonysága növelhető a transzfer idejének növelésével, illetve 0.01% SDS-t is adhatunk a transzfer pufferhez, de ez redukálja a nitrocellulózhoz való kötődést is. A transzfer hatékonysága nyomon követhető színes protein standard-ek blottolásával. A transzferre azért van szükség, mivel a nagyméretű antitestek a gél szűk pórusain keresztül nehezen jutnak el a protein antigénekhez, míg a membránok felszínén kötődő proteinek könnyen hozzáférhetők. A blott azonnal analizálható, vagy 2-8 oC-on néhány hónapig eltartható. A specifikus antitest hozzáadása előtt, a nagymértékű aspecifikus antitestkötődés (ez is fehérje) gátlása céljából, a membránok transzferált proteineket nem kötő helyeit blokkoljuk, azaz inert, fehérjetermészetű anyagokkal (pl. zselatin, szérum albumin) borítjuk. Ezután, specifikus poliklonális vagy monoklonális antitesttel reagáltatjuk a membránra átvitt fehérjéket. A protein-antitest komplexet úgy mutatjuk ki, hogy anti-IgG-enzim komplexet kötünk hozzá, majd az enzim szubsztrátjával történő reakcióját színes végterméket adó reagenssel láthatóvá tesszük. A reakció érzékenységét növelhetjük sokszoros enzimkötéssel vagy fluoreszcens módszerrel (anti-IgG-fluoreszcens anyag komplexet kötünk a specifikus antitesthez) történő kimutatással. Ugyanazon a blotton, egymást követően néhány reakció lejátszatható, ha a próbát minden alkalommal eltávolítjuk.

A nem blokkolt N terminálist tartalmazó fehérjékből az N-terminális peptid meghatározható Edman-lebontással is (8.12. ábra). A kapott peptid szekvenciákat az ismert nukleotid/fehérje szekvenciákkal összevetve a protein azonosítható.

Edman-lebontás. A polipeptid N-terminális aminosavát (R1 oldallánc) fenil-izotiocianát hozzáadásával fenil-tiohidantoin-R1 komplex formájában lehasítjuk. A lehasított funkciós csoportot azonosítjuk. A reakció ismétlésével az N-terminális szekvencia aminosavról aminosavra meghatározható. A szekvenciát adatbázisokkal összevetve a protein azonosítható.

8.12. ábra. Edman-lebontás. A polipeptid N-terminális aminosavát (R1 oldallánc) fenil-izotiocianát hozzáadásával fenil-tiohidantoin-R1 komplex formájában lehasítjuk. A lehasított funkciós csoportot azonosítjuk. A reakció ismétlésével az N-terminális szekvencia aminosavról aminosavra meghatározható. A szekvenciát adatbázisokkal összevetve a protein azonosítható.

A leggyakrabban tömegspektrográfiás módszerrel azonosítják a proteineket. A proteinfoltokat/sávokat kivágják a gélből és eltávolítják a festéket. Ezután specifikus proteázzal emésztik, leggyakrabban tripszinnel, ami a Lys és Arg C-terminális oldalán hasít. Így 0,5-2 kDa méretű peptidekre bontják a proteint. Ezután MALDI TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight) vagy ESI-Q-TOF (ElectroSpray Ionisation Quadrupole Time-of-Flight) módszerrel peptideket választanak el. A MALDI TOF spektrumok esetében a tömeg/töltés (m/z) függvényében kapják a peptid intenzitást. Az m/z peptid összetételt összehasonlítva az adatbázisokból nyert szekvenciák elméleti hasításával előállítható peptidek m/z értékeivel azonosítják a proteint. Az ESI-Q-TOF esetében a peptidek közül a kiválasztottat tovább hasítják, és az így nyert kis darabok m/z aránya alapján szekvenciák nyerhetők, amiből az adatbázisok alapján a protein azonosítható. Tömegspektrográfiával inkább csak kvalitatív információk nyerhetők, kvantitatív meghatározásra kevésbé alkalmas.

A fehérjéket jellemezhetjük/azonosíthatjuk specifikus reakciók alapján is. Ezek a fehérjék valamilyen módosítására (foszfoproteinek, glikoproteinek, lipoproteinek), illetve aktivitására (enzimreakciók) utalnak (ld. detektálás).