8.2. PAGE gyakorlatok

Vigyázat!

A polimerizálatlan akrilamid idegméreg. (A polimerizáció sohasem 100%-os!) A TEMED rákkeltő, a többi anyag hatása nem kellőképpen tisztázott.

Kesztyűben dolgozzunk! Automata pipettával mérjük be az oldatokat!

8.2.1. A fehérjék elválasztása denaturáló poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS PAGE)

Gélöntés: A gélek elkészítéséhez szükséges elegyek összemérése előtt helyezzük a gélkazettákat az öntőkádba. A szeparáló gél 10-18-os (w/v) lineáris akrilamid gradienst, 0,375 M Trisz-HCl-t (pH 8,8), 10% glicerint (v/v) és 0,1% (w/v) SDS-t, a tömörítő gél 5% (w/v) akrilamidot, 0,125 M Trisz-HCl-t (pH 6,8), 10% glicerint (v/v) és 0,1% (w/v) SDS-t tartalmaz. Az akrilamid-biszakrilamid arány 30:0,8. A polimerizációt a szeparáló gélben 0,013-0,017% (v/v) TEMED gradiens és 0,04% (w/v) AP, a tömörítő gélben 0,055% (v/v) TEMED és 0,1% (w/v) AP hozzáadásával indítjuk. A gélöntéshez (4 db 7x10 cm-es 1,5 mm vastag gél) a következő elegyeket állítsuk össze (8.1. táblázat):

8.1. táblázat. Denaturáló poliakrilamid gél összemérése

  Szeparáló Tömörítő

% akrilamid

10%

18%

5%

B (szep.), C (töm.)

4,0 ml

4,0 ml

5,0 ml

A

2,7 ml

4,8 ml

1,7 ml

60% (w/v) szacharóz

0,8 ml

2,4 ml

-

Glicerin

1,6 ml

1,6 ml

2,0 ml

Bidv

6,8 ml

2,1 ml

11,0 ml

10% (v/v) TEMED

25 µl

20 µl

110 µl

10% (w/v) AP

60 µl

60 µl

220 µl

Σ

16 ml

16 ml

20 ml

Alárétegzéshez: 3 ml 30%-os (w/v) szacharóz.

Az összetevőket az AP oldat kivételével szívópalackban mérjük össze, majd az oldott levegőt vízlégszivattyúval távolítjuk el (kb. 0,5-1 min). Az AP hozzáadása után a gélelegyeket azonnal gradiens keverőn keresztül az előkészített öntőkádba juttatjuk, majd 30%-os szacharóz oldatot rétegzünk alá azért, hogy a géloldat teljes egészében a kazettákba kerüljön. A polimerizáció után (a víz és a gélkeverék közti éles határfelület eltűnik, majd újból megjelenik) a vizet szűrőpapír csíkkal leszívatjuk, ráöntjük a szeparáló gélelegyekhez hasonlóan előkészített tömörítő gélelegyet, és beletesszük a mintahelyek kialakítására szolgáló fésűket. A 6%-nál töményebb géleket a tökéletes polimerizáció érdekében a felhasználás előtt egy nappal öntjük.

Szolubilizáció: A tilakoid membránokat (0,3 mg klorofill ml-1 ~ 1 mg fehérje ml-1) szolubilizáló pufferben (62,5 mM Trisz-HCl (pH 6,8), 2% (w/v) SDS, 2% (w/v) DTT, 10% (v/v) glicerin és 0,001% (w/v) brómfenolkék), szobahőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. (A tetszőleges pufferben lévő membránfehérjékhez 1/3 térfogatban 3-szoros töménységű szolubilizáló puffert adunk – maximum 1 mg fehérje ml-1). A nem szolubilizálódott anyagot centrifugálással (5 min, 10000 g) távolítjuk el.

Elektroforézis: Tegyük a kész géleket a készülékbe. 20-50 µg fehérjét tartalmazó szolubilizált mintát vagy 5 µg fehérjét tartalmazó standard fehérjekeveréket vigyünk fel a mintahelyekre. Töltsük fel a készüléket tartálypufferrel (0,025 M Trisz, 0,192 M glicin (pH 8,3), 0,1% (w/v) SDS). Az elektroforézist hűtőszekrényben, 20 mA/lap állandó áramerősséggel végezzük, amíg a jelzőfesték eléri a gél végét (~2 h).

Egyszerű festés: A géleket 50% (v/v) metanolt, 7% ecetsavat (v/v) és 0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250-et tartalmazó oldattal festjük legalább 3 órán keresztül. A háttérfestődés eltávolítása érdekében a géleket 30%-os (v/v) metanolt és 10% (v/v) ecetsavat tartalmazó oldatban mossuk a háttér elszíntelenedéséig. Fixálás, festés és mosás közben a géleket folyamatosan billenő asztalon rázatjuk. A tárolás 7%-os (v/v) ecetsavban történik.

Blue Silver módszer: A géleket 50% (v/v) metanol, 2% (w/v) foszforsav elegyében fixáljuk (legalább 1 h). Ezután 3x20 min bidv-zel mossuk. A festés 0,12% (w/v) CBB G-250-et, 10% (w/v) ammóniumszulfát, 10% (w/v) foszforsav, 20% (v/v) metanol elegyében történik (1-2 h, vagy amíg a sávok erősen festődnek). A háttérfestődést bidv-es mosással távolíthatjuk el, ha szükséges, és a gélek tárolása is bidv-ben történik.

A gélek értékelése: A megfestett géleket szkennelt/fényképezett képről értékeljük. A géleket szkennelés vagy fényképezés céljából – árnyéksávok megjelenésének elkerülése érdekében – alulról kell megvilágítani. A szkennelt gélek sávdenzitását denzitometráló programmal (Phoretix 4.01, Phoretix International, Newcastle-upon-Tyne, UK) értékeljük. A MW meghatározásához kalibrációs görbét készítünk: a standard fehérjék MW-ének logaritmusát a T% (az összes monomer %-a a gélben, a szeparáló gél elejétől a végéig 10,3%-18,5% között változik) logaritmusának függvényében ábrázoljuk. Az ismeretlen fehérjék MW-ét a szeparáló gél elejétől mért futási távolságukból számolt T% ismeretében, a kalibrációs görbe felhasználásával határozzuk meg.

8.2.2. Enzimek elválasztása natív poliakrilamid gélelektroforézissel

Mintakészítés: 100 mg friss növényi anyagot 1 ml izoláló elegyben (50 mM Na-K-foszfát puffer (pH 7,8), 2 mM MgSO4, 2 mM EDTA, 2% (w/v) nem oldódó polivinil-pirrolidin) homogenizálunk. A szolubilis proteineket 10 min 15000 g centrifugálást követően a felülúszóban kapjuk.

Szolubilizálás: A mintákat futtatás előtt enyhén szolubilizáljuk 5 mM Trisz-HCl (pH 6,8), 0,01% (w/v) SDS, 10% (v/v) glicerin, 0,001% (w/v) brómfenolkék oldatban.

Elektroforézis: Ugyanúgy történik, mint a denaturáló PAGE, de a gélpufferek nem tartalmaznak SDS-t, és a kádpufferhez is csak 0,001% (w/v) SDS-t adunk. Az enzimpreparátumot szolubilizálás nélkül, de 10% (v/v) glicerint hozzáadva visszük fel a gélre.

Aktivitásfestés:

Class-III peroxidázok (POX; E.C.1.11.1.7.) hem kofaktorral működő enzimek, amelyek H2O2 felhasználásával oxidálnak fenolos és kinon típusú vegyületeket. A pozitív színreakció előhívását 2 mM benzidin (DMSO-ban oldva), 3 mM H2O2, 50 mM K-acetát puffer (pH 4,5) jelenlétében végezzük (30 min). A POX enzimreakció a benzidin konjugációját okozza, ezért az enzim izoformák aktivitásának helyén barna színreakciót kapunk. A reakció bidv-es mosással történő leállítását követően a géleket 50% metanolban fixáljuk.

A szuperoxid diszmutázok (SOD; E.C. 1.15.1.1.) fém kofaktorral működő enzimek (megkülönböztetünk FeSOD, MnSOD és Cu/ZnSOD típusú enzimeket, melyek közül a FeSOD és MnSOD enzimek egymás rokonai, míg a Cu/ZnSOD izoformák nem mutatnak az előző kettővel szekvencia homológiát), a szuperoxid anion gyök (O2·-) vízzé és hidrogén-peroxiddá történő diszmutációs reakcióját katalizálják a reaktív oxigénformák (ROS) elleni védekezés kezdő lépéseként. A SOD izoformák kimutatása negatív színreakcióval történik. A gélt 50 mM Na-K-foszfát puffer (pH 7,8), 0,1 mM EDTA, 13 mM metionin, 60 μM riboflavin, 2,25 mM nitroblue-tetrazólium-klorid (NBT) oldatában történő 15 perces sötétben történő előinkubáció után 30 percre megvilágítjuk. Megvilágítás hatására a riboflavin a metioninnal O2·- gyököket generál, melyek az NBT-vel reagálva lila színreakciót adnak. A SOD enzimreakció mellett a lila elszíneződés elmarad, így a gélben aktív enzimek helyén negatív (nem festődő) sávok tűnnek elő. A reakció bidv-es mosással történő leállítását követően a sávokat azonnal detektáljuk.

A gélek értékelése: A szkennelt gélek sávdenzitását denzitometráló programmal értékeljük.

8.2.3. Izoelektromos fókuszálás (IEF)

Proteinextrakció: A fehérjeoldatból 80% (v/v) acetont és 0,07% (v/v) β-mekaptoetanolt tartalmazó oldattal -20 °C-on kicsapjuk a fehérjéket (1 éjszaka, de minimum 1 h). A kicsapódott fehérjéket centrifugálással ülepítjük (10 min, 14000 g), egyszer mossuk a fenti oldattal (felszuszpendálva 1 órát állni hagyjuk, majd újra centrifugáljuk). A fehérje csapadékot nyitott Eppendorf csőben -20 °C-on vagy nitrogéngázzal beszárítjuk.

Rehidratáció: Készen vett strip-eket használunk. 7 cm-es strip esetén 50 μg proteint viszünk fel 125 μl rehidratáló oldatban: 2 M tiourea, 8 M urea, 20 mM Trisz, 4% (w/v) CHAPS, 50 mM DTT, 0,05% (w/v) n-dodecil-β-D-maltozid, 2 mM PMSF, 0,5% (v/v) amfolin (pH 3-10). Az oxidáció elkerülésére kőolajdesztillátumot rétegzük a strip fölé. A rehidratáció 24 °C-os termosztátban (1 éjszaka, de minimum 2 h) történik.

Elektroforézis: Az elektroforézist állandó feszültségen, kőolajdesztillátum alatt végezzük a következő program szerint (8.2. táblázat):

8.2. táblázat. Izoelektromos fókuszálás részfolyamatai

Feszülség

Idő

V – h

Mód

1)

250 V

20 min

------

Lin,

2)

4000 V

2 h

------

Lin,

3)

4000 V

------

10000

Gyors

Totál

------

~5 h

14000

------

4) [opcionális]

500 V

leállításig

------

------

Az elektroforézist követően a strip-ek -80 °C-on, kőolajdesztillátum alatt tárolhatók.

A második dimenziós futtatás előtt a strip-eken elvált, az pI pontjaiknál denaturálódott proteineket két lépcsőben szolubilizáljuk. A lecsurgatott strip-eket 6 M urea, 0,375 M Trisz (pH 8,8), 2% (w/v) SDS, 20% (v/v) glicerin, 2% (w/v) DTT oldatban (10 min), majd 6 M urea, 0,375 M Trisz (pH 8,8), 2% (w/v) SDS, 20% (v/v) glicerin, 2,5% (w/v) jód-acetamid oldatban (10 min) inkubáljuk. Ennek a célja, hogy a kicsapódott proteineket visszaoldjuk (SDS), denaturáljuk (redukálószer és SDS), illetve a denaturált állapotot fenntartsuk (alkilálószer). Az optimális szolubilizálás eléréséhez fontos az inkubációs idők betartása. A második inkubáció után a strip-ekről a denaturáló elektroforézishez használt kádpufferrel le kell öblíteni a szennyeződésként rajta maradt kőolajdesztillátumot. A strip-eket brómfenolkéket tartalmazó, 0,5% (w/v) agarózzal szilárdított kádpufferben buborékmentesen rögzítjük a denaturáló gél tetejére.

8.2.4. Natív állapotú fehérjekomplexek elválasztása „blue-native” poliakrilamid gélelektroforézissel (BN-PAGE)

Gélöntés: A gélek elkészítéséhez szükséges elegyek összemérése előtt helyezzük a kazettákat az öntőkádba. A szeparáló gél 5-12%-os (w/v) lineáris akrilamid gradienst, 50 mM Bisz-Trisz-HCl puffert (pH 8,8) és 500 mM 6-aminokapronsavat, a tömörítő gél 4% (w/v) akrilamidot, 50 mM Bisz-Trisz-HCl puffert (pH 8,8) és 500 mM 6-aminokapronsavat tartalmaz. Az AA/Bis arány 32:1. A polimerizációt a szeparáló gélben 0,03-0,05 % (v/v) TEMED gradiens és 0,03-0,05% (w/v) AP gradienst, a tömörítő gélben 0,1% (v/v) TEMED és 0,1% (w/v) AP hozzáadásával indítjuk. A gélöntéshez (4 db 7x10 cm-es 1,5 mm vastag gél) a következő elegyeket állítsuk össze (8.3. táblázat):

8.3. táblázat. BN-PAGE összemérése.

 

Szeparáló Tömörítő

% akrilamid 

5%

12%

4%

3xGB

5,5 ml

5,5 ml

7 ml

AB

1,7 ml

4,1 ml

1,75 ml

60% (w/v) szacharóz

0,8 ml

2,5 ml

-

Glicerin

1,6 ml

1,6 ml

2,1 ml

Bidv

6,8 ml

2,7 ml

9,0 ml

TEMED

8 ul

5 ul

20 ul

10% (w/v) AP

80 ul

50 ul

200 ul

Σ

16,5 ml

16,5 ml

20 ml

Alárétegzéshez: 3 ml 30%-os (w/v) szacharóz.

Mintaelőkészítés: A membránokat 330 mM szorbitolt, 50 mM Bisz-Trisz-HCl-t (pH 7,0) és 250 µg ml-1 Pefabloc-ot (proteáz gátló) tartalmazó pufferben felszuszpendálva és centrifugálva (10 min, 10000 g) mossuk.

Szolubilizálás: A membránokat 750 mM 6-aminokapronsavat, 50 mM Bisz-Trisz-HCl-t (pH 7,0), 0,5 mM EDTA-t, 250 µg ml-1 Pefabloc-ot és 2% (w/v) n-dodecil-β-D-maltozidot tartalmazó szolubilizáló pufferben (0,5 mg ml-1 klorofill vagy 50-100 µg fehérje) 0oC-on inkubáljuk (30 min). A nem szolubilizálódott membránokat centrifugálással (20 min, 20000 g, 4 oC) távolítjuk el. 100 µl felülúszóhoz 20 µl 750 mM 6-aminokapronsavat és 5% (w/v) Serva Blue G-t (SBG) tartalmazó oldatot adunk.

Elektroforézis: Tegyük a kész géleket a készülékbe. Töltsük fel a kádat felső (15mM Bisz-Trisz, 50 mM Tricin (pH 7,0), 0,02% (w/v) SBG) és alsó (50mM Bisz-Trisz, pH 7,0) tartálypufferrel. 20 µl szolubilizált anyagot vagy szolubilizáló puffert (üres helyek) vigyünk fel a mintahelyekre. Az elektroforézist hűtőszekrényben, először 15 min 40 V állandó feszültséggel (5 mA/gél) végezzük, majd 120 V állandó feszültséggel, amíg a front eléri a gél közepét (~60 min). Ezután kicseréljük a felső puffert festék nélküli pufferre, és addig futtatjuk, míg a festék eléri a gél végét (~ 3 h).

8.2.5. Western blotting

Transzfer: a géleket buborékmentesen a blottoló pufferrel (25 mM Trisz, 192 mM glicin, pH 8,3, 20 % (v/v) metanol – ez utóbbi csökkenti a gél méretváltozását, elősegíti a nitrocellulóz fehérjekötését) megnedvesített nitrocellulóz membránra helyezzük, és a tartót megnedvesített szűrőpapírokkal kibélelve (hogy a gél és a membrán egymáshoz képest ne mozdulhasson el) a blottoló kádba tesszük. A blottolás 3 óra hosszat, 4-6 oC-on, 90 V állandó feszültségen (<0,4 A) történik.

Minden további folyamat szobahőmérsékleten történik miközben billenő asztalon rázatjuk a membránokat.

Blokkolás (csökkenti a nem-specifikus antitest-kötődést a fehérjét nem kötő membránrészeken): a bidv-zel alaposan lemosott membránokat 60 percig infralámpával melegített 3 % (w/v) zselatint tartalmazó TBS-ben (Tris Buffered Saline: 20 mM Trisz, 500 mM NaCl, pH 7,5) rázatjuk.

Specifikus antitestkezelés (specifikus kötődés az adott proteinhez): antitest pufferben (1% [w/v] zselatin TBS-ben) megfelelő koncentrációban oldott antitesttel rázatás 1 éjszakán keresztül (műanyag zacskóba hegesztve kevesebb antitest szükséges).

Mosás: 2 x 20 min rázatás TTBS oldatban (0,05% Tween 20-tartalmú TBS-ben – a nem specifikusan kötődő antitest eltávolítására), majd 2 x 20 min TBS-ben.

2. antitestkezelés: 2 óra inkubálás 60 ml antitest pufferben, amely 20 µl második antitestet (minden, az adott állatból származó első antitesttel reagál, és egy kötött enzim van rajta) tartalmaz.

Mosás: 2 x 20 min rázatás TTBS oldatban, majd 2 x 20 min TBS-ben.

Előhívás: Keverjünk össze 100 ml 60 µl 30%-os H2O2-t tartalmazó 4 oC-os TBS-t 20 ml 60 mg HRP (horse radish peroxidase) reagenst (fényérzékeny) tartalmazó -18 oC-os metanollal (frissen készítendő). A keverékben rázogassuk a membránokat (lejátszódnak az enzimreakció és a színreakciók), míg a sávok, foltok elég erősen látszanak. Az enzimreakciót bidv-es mosással állítjuk le.

Értékelés: A membránokat szkenneljük/fényképezzük, és denzitometráló programmal kiértékeljük.

8.2.6. Proteinek elektroforézisekor felmerülő gyakori problémák

  1. A nagy T%-os gél törik a polimerizáció alatt - nagy a hőképződés, hűtsük le az oldatokat.

  2. A gél buborékokat tartalmaz a polimerizáció után - az oldatokat gáztalanítsuk.

  3. A tápegység nem mutat áramerősséget - valahol rossz a kontaktus.

  4. A kiindulási feszültség (állandó áramerősséggel való futtatáskor) eltér a szokásostól - nem jó a puffer, illetve valahol elektromosan átereszt a rendszer.

  5. Az elválasztás után a sávok nem egyenesek

    1. a gélek vagy a mintahelyek a polimerizáció vagy átrakás során torzultak (~),

    2. nem megfelelő a kontaktus a gél és az üveg vagy a gél és távtartó közt (?),

    3. „smile-effect” (◡) - az elektroforézis során a gél túlmelegszik a túl magas alkalmazott áramerősség vagy a nem megfelelő hűtés miatt.

  6. A festés után a gél teteje festődik (oldhatatlan proteinek a gél tetején)

    1. a gél T%-a nem megfelelő,

    2. túl alacsony a denaturáló ágensek koncentrációja,

    3. túl alacsony a minta pH-ja (pl. TCA-as koncentrálás után),

    4. a diszkontinuus rendszer nagyon koncentrálta a proteineket, amelyek aggregálódtak,

    5. a minta hőkezelése túl magas hőmérsékleten történt, a proteinek aggregálódtak,

    6. nem megfelelően távolítottuk el a nem szolubilizálódott anyagokat centrifugálással.

  7. A protein kenődik a gél egész hosszában (a sávban a háttérfestődés magas)

    1. nem megfelelő a szolubilizáció

    2. kontamináció jelenléte

  8. A sávmintázat nem reprodukálható (pl. nagymennyiségű kis móltömegű komponens jelenik meg proteolízis következtében) - proteázok adása, hőkezelés.