8.4. Függelék

Oldatok készítése:

Az AA oldhatósága 30 oC-os vízben 2 g ml-1, oldata sötét üvegben, 4 oC-on 1-2 hónapig stabil (fény, ultrahang és γ-sugárzás hatására imid-hidak képződnek az amid csoportok intermolekuláris polimerizációjával). Hosszabb idő alatt hidrolizálhat akrilsav és NH3 keletkezése közben (az akrilsav megköthető, ha az oldathoz kevés Dovex 1 vagy Amberlite IRA-400 bázikus ioncserélő gyantát adunk). A Bis oldhatósága 20 oC-os vízben 0,31 g ml-1, oldata hasonlóan érzékeny, mint az AA. Az AP oldata maximum néhány napig stabil 4 oC-on tartva. Minden alkalommal friss oldat készítése ajánlott. A TEMED színtelen vagy halványsárga, olajszerű, kellemetlen szagú folyadék, amely sötét üvegben 4 oC-on eltartható. Az öregedés során sárgul.

Az oldatokat, ha másképpen nem jelöltük, 4 oC-on tartjuk.

SDS-PAGE

Akrilamid-biszakrilamid keverék (A: 60% AA, 1,6 % Bis, tárolás sötét üvegben)

60,0 g

akrilamid (AA)

1,6 g

Bis

ad 100 ml bidv

4x tömény szeparáló gélpuffer (B: 1,4 M Trisz-HCl-t (pH 8,8), 0,4% (w/v) SDS-t )

18,17 g

Trisz

0,4 g

SDS

ad 100 ml bidv

4x tömény tömörítő gélpuffer (C: 0,5 M Trisz-HCl-t (pH 6,8), 0,4% (w/v) SDS)

6,06 g

Trisz

0,40 g

SDS

ad 100 ml bidv

3x tömény szolubilizáló puffer (3xL: 187,5 mM Trisz-HCl (pH 6,8), 6% (w/v) SDS, 6% (w/v) DTT, 30% (v/v) glicerin és 0,003% (w/v) brómfenolkék

7,5 ml

glicerin

1,5 ml

DTT

9,5 ml

C

1,5 g

SDS

ad 25 ml bidv

4x tömény kádpuffer (0,1 M Trisz [pH 8,3], 0,768 M glicin, 0,4% SDS)

18,0 g

Trisz

86,4 g

glicin

ad 1500 ml bidv

Blue silver festékoldat (elkészítésénél fontos a jelölt sorrend betartása, tárolás szobahőmérsékleten, sötét üvegben!)

55 ml

bidv

10 ml

orto-foszforsav

10 g

ammónium-szulfát (feloldani!)

0,12 g

CBB G250 (feloldani!)

20 ml

metanol (keverés közben)

ad 100 ml bidv

BN PAGE

1,65 M szorbitol (tárolás -20 oC-on!)

30,63 g

szorbitol

ad 100 ml bidv

1 M Bisz-Trisz-HCl (pH 7,0)

20,92 g

Bisz-Trisz

ad 100 ml bidv

Mosó puffer (330 mM szorbitol, 50 mM Bisz-Trisz-HCl [pH 7,0], 250 µg ml-1 Pefabloc)

0,5 ml

1 M Bisz-Trisz-HCl (pH 7,0)

2,0 ml

1,65 M szorbitol

2,5 mg

Pefabloc

ad 10 ml bidv

2M 6-aminokapronsav (AC)

13,12 g

6-aminokapronsav

ad 50 ml bidv

Szolubilizáló puffer (750 mM 6-aminokapronsav, 50 mM Bisz-Trisz-HCl [pH 7,0], 0.5 mM EDTA, 250 µg ml-1 Pefabloc and 2% (w/v) n-dodecil-β-D-maltozid) (tárolás -20 oC-on!)

0,1 ml

1 M Bisz-Trisz-HCl (pH 7,0)

0,75 ml

2M 6-aminokapronsav

5 µl

200 mM EDTA

0,4 ml

10% (w/v) n-dodecil-β-D-maltozid

0,5 mg

Pefabloc

ad 2 ml bidv

3x tömény gélpuffer (3xGB: 1,5M 6-aminokapronsav, 150 mM Bisz-Trisz-HCl, pH 7,0)

19,68 g

6-aminokapronsav

3,14 g

Bisz-Trisz

ad 100 ml bidv

Katód (felső) puffer (CB: 15mM Bisz-Trisz, 50 mM Tricin [pH 7,0] – nem kell beállítani a pH-ját!)

3,14

Bisz-Trisz

8,96 g

Tricin

ad 1000ml bidv

Kék katód puffer (15mM Bisz-Trisz és 50 mM Tricin [pH 7,0], 0,02% SBG) (tárolás szobahőmérsékleten!)

100 ml

katód puffer

20 mg

SBG

Anód (alsó) puffer (50mM Bisz-Trisz-HCl, pH 7,0)

20,93 g

Bisz-Trisz

ad 2000 ml bidv

Akrilamid-biszakrilamid keverék (AB: 48% (w/v) akrilamid, 1.5% (w/v) biszakrilamid, tárolás sötét üvegben)

24,0 g

akrilamid (AA)

0,75 g

biszakrilamid (Bis)

ad 50 ml bidv

Szolubilizáláshoz SBG (750 mM 6-aminokapronsav, 5% (w/v) SBG)

0,375 ml

2M 6-aminokapronsav

0,05 g

SBG

ad 1 ml bidv

Western blotting

TBS (20 mM Trisz-HCl [pH 7,5], 500 mM NaCl) (tárolás szobahőmérsékleten)

4,84 g

Trisz

58,44 g

NaCl

ad 2000 ml bidv

TTBS (20 mM Trisz-HCl [pH 7,5], 500 mM NaCl, 0,05% [w/v] Tween 20) (tárolás szobahőmérsékleten)

800 ml

TBS

400 μl

Tween 20

Aktivitásfestés

POX (50 mM K-acetát puffer [pH 4,5], 2 mM benzidin [DMSO-ban oldva], 3 mM H2O2)

1,4 ml

10% KOH

140 μl

100% CH3COOH

18,5 mg

benzidin (2 ml DMSO-ban oldva először!)

15 μl

H2O2

ad 50 ml bidv.

SOD (50 mM Na-K-foszfát puffer [pH 7,8], 0,1 mM EDTA, 13 mM L-metionin, 60 μM riboflavin, 2,25 mM nitroblue-tetrazólium-klorid; sötétben tartandó!)

9,35 ml

500 mM Na2HPO4

0,65 ml

500 mM KH2PO4

25 μl

200 mM EDTA (pH 7,8)

97 mg

L-metionin

1,1 mg

riboflavin

92 mg

NBT (nitroblue-tetrazólium-klorid)

ad 50 ml bidv.