9. fejezet - RNS kinyerése növényekből

szerző: Dr. Rudnóy Szabolcs

Tartalom

9.1. Miért pont az RNS?
9.2. Néhány szó az RNS-ről
9.2.1. Az RNS általában
9.2.2. Az RNS a növényekben
9.3. Az RNS kinyerése
9.3.1. A kinyerés általános jellemzői
9.3.2. A minta feltárása és a makromolekulák denaturációja
9.3.3. A fehérjék eltávolítása és az RNS tisztítása
9.3.4. Az RNS koncentrálása
9.3.5. mRNS-ek és kis RNS-ek kinyerése
9.4. A kivonat ellenőrzése
9.4.1. UV-spektrofotometria
9.4.2. Agaróz gélelektroforézis
9.4.3. Egyéb ellenőrzési lehetőségek
9.5. Az RNS tárolása
9.6. Egy gyakran alkalmazott kinyerési recept
9.7. Feladatok
9.8. Ajánlott irodalom

9.1. Miért pont az RNS?

Miért is érdemes tanulmányozni az RNS-t? A sejtek és szövetek minden működését végső soron a génexpresszió szabályozza, amelyet a génektől a fehérjékig az RNS közvetít. A transzkripció, ill. génexpresszió változása számtalan tudományos kérdést vet föl, amelyek leggyakrabban egy vagy több transzkriptum mennyiségének megváltozása körül forognak. A legfontosabb ilyen kérdések:

  1. Egy sejt (vagy egy kompartment) egy vagy több transzkriptumának mennyisége egyensúlyi állapotban, azaz a szintézis, a stabilitás és a lebontás nettó eredményeképpen. Ez a génexpresszió leggyakoribb vizsgált jellemzője, mivel a kinyerhető RNS-ből ez az információ szűrhető le legegyszerűbben. Az RNS mennyiségi és minőségi vizsgálatát sokféle módszer alkalmazása segíti (PCR-alapú technikák, Northern analízis, nukleázos emésztés, stb.).

  2. A transzkripció sebességének, vagy az RNS-érés valamely folyamata sebességének mérése. Ehhez gyakran alkalmaznak radioaktív jelölésű nukleotidokat, amelyek beépülése egyenes arányban mutatja az adott RNS előfordulását. Ha Northern analízissel, vagy hasonló, olyan vizsgálattal kombinálják, amely az egyensúlyi állapotban fennálló RNS-szintet méri, a transzkripciós és a transzkripció utáni szabályozás is vizsgálható.

  3. A transzkripciós kezdőpont meghatározása. Az mRNS-molekulák térképezését eredetileg nukleázos emésztéses módszerrel határozták meg: a keresett szekvenciához antiszensz szálat hibridizáltak, majd az összes többi, egyes szálú RNS-t erre specifikus nukleázzal elemésztették, végül a megmaradt RNS-t vizsgálták tovább. Manapság viszont inkább a RACE módszer (rapid amplification of cDNA ends) használatos, ahol az mRNS 3’- és/vagy 5’-végét sokszorozzák meg egy belső és egy, a molekula végén kötő, ún. horog primer segítségével. Mivel egy adott genetikai lókuszról, pl. szövettől függően, többféle mRNS szintetizálódhat és mindegyik más-más transzkripciós kezdőpontból, e pont meghatározása igencsak fontos lehet.

  4. A komplementer DNS (cDNS) szintézise. Az instabil egyes szálú mRNS templátként szolgál a sokkal stabilabb egyes, vagy kettős szálú cDNS in vitro szintéziséhez. A cDNS-t PCR technikával szaporítják föl, pl. a következő célokból: mennyiségi meghatározás; transzkript-térképezés, vektorba ligálás (szekvenálás, vagy a kódolt fehérje expresszálása céljából); két vagy több cDNS elválasztása; ill. teljes cDNS-könyvtár létrehozása hosszabb távú tárolás és vizsgálat céljából. Ilyenkor az adott sejt/szövet „biokémiai pillanatfelvétele” készül el, ami sokáig az egyik legfontosabb, ugyanakkor legtöbb kihívást tartalmazó feladatnak számított a molekuláris biológiai laboratóriumokban.

  5. A tisztított mRNS in vitro transzlációja. A keletkező fehérje tovább vizsgálható Western analízissel, vagy immunprecipitációval. A módszer annak eldöntésére is alkalmas, hogy ha egy lókuszról alternatív transzkripciós kezdőpontokkal többféle mRNS szintetizálódik, vajon mindegyik alkalmas-e a kódolt fehérje szintézisére? Fehérjék tervezésénél szintén elengedhetetlen a módszer, hiszen a keletkezett fehérje szerkezeti és funkciós vizsgálataihoz szükség van az mRNS vizsgálatára és transzlációjára.