9.2. Néhány szó az RNS-ről

9.2.1. Az RNS általában

Az RNS ribonukleozid-monofoszfát (NMP) monomerekből álló, elágazás nélküli, láncjellegű polimer molekula, amelynek egységei foszfodiészter kötésekkel kapcsolódnak egymáshoz. Mind a pro-, mind az eukariótákban létfontosságú vegyülettípus. Alapvetően egyes szálú láncot képez, de ismertek kettős szálú RNS-molekulák is. Az RNS két fő különbsége kémiailag DNS-hez képest az uracil (U) bázis, ill. a ribóz cukormolekula jelenléte a timin (T), ill. a dezoxiribóz helyett. Ezeken kívül számos módosult bázis figyelhető meg az RNS-ben, különösen az rRNS és tRNS típusokban. E kémiai különbségek jelentős szerkezeti változásokat okoznak, így az RNS alapvetően egyes szálú struktúrában van jelen a sejtben, viszont képes saját láncán belül, ill. más nukleinsav molekulákkal Watson-Crick bázispárokat kialakítani és kettős szálú szerkezeti elemeket képezni. Számos RNS összetett másodlagos és harmadlagos szerkezetet vesz föl (rRNS, tRNS, sok kis RNS), más típusok láncaiban a bonyolultabb szerkezeti elemek egyes szálú részekkel váltakoznak (sok mRNS). Az A-T bázispár helyett itt A-U pár jelenik meg, de az U képes ún. „lötyögő” bázispárt létrehozni guaninnal is. A kémiai különbség következménye az RNS kisebb fizikai stabilitása is: a ribóz 2’OH-csoportja nukleofil reakciókban vehet részt a szomszédos foszfodiészter kötéssel, pl. lúgos közegben, vagy (nehéz)fémionok hatására.

Sok különféle RNS-típust ismerünk, amelyek mindegyike szerteágazó és fontos funkciót lát el a sejt működésében. Az RNS alapvető szerepei közt tartjuk számon a transzkripció (mRNS), az érés vagy splicing (snRNS), a transzláció (tRNS, tmRNS) és a transzkripciós és azutáni szabályozás (miRNS, siRNS) folyamatait. A sejt RNS közvetítésével szintetizálja fehérjéit, amelyek aktivitását első szinten az RNS-anyagcsere befolyásolásával szabályozza. A már felhasznált mRNS-ek gyorsan lebomlanak RNáz enzimek közreműködésével, amelyek viszont komoly veszélyt jelentenek az RNS kinyerésére nézve és hatékony semlegesítésük a sikeres kinyerés egyik alapvető kritériuma.

9.2.2. Az RNS a növényekben

A növények is eukarióta szervezetek, mint az állatok és a gombák, és hozzájuk hasonlóan bonyolult génexpressziós hálózatokkal és szabályozási folyamatokkal rendelkeznek. Így az állati szövetekhez, sejtekhez alkalmazott technikák az alapjai a növényeknél használatos módszereknek is. A növényi biotechnológia intenzív fejlődése megkövetelte a jó minőségű RNS kinyerését a legkülönbözőbb növényi szövetekből (levél, gyökér, kéreg, virág, termés, mag, ill. sziklevél). Mivel a növények a környezeti körülmények változása esetén nem képesek helyük változtatásával reagálni, anyagcseréjüket változtatják meg, így RNS-profiljuk feltérképezése különösen fontos, amikor stresszreakcióikat próbáljuk megérteni. Napjainkban számos kutatás igyekszik felderíteni pl. a hidegedződés, vagy a különböző abiotikus és biotikus stresszhatások esetén indukálódó növényi géneket, ill. ezek kifejeződési mintázatát és szabályozási hálózatait. A bioüzemanyagok előállításához szükséges növényi gének vizsgálata szintén erősen kutatott terület. Eddigi ismereteink szerint a növényi RNS valamivel ellenállóbbnak tűnik a környezeti hatásokkal szemben, mint az állatoké, ami jó hír a laboratóriumban dolgozók számára és kedvező a hosszabb távú tárolás és vizsgálatok szempontjából is.

A növényi sejt három legfontosabb jellemzője, egyben az állati sejtektől megkülönböztető jegye a sejtfal, a nagy, központi vakuólum és a kloroplasztisz. Az RNS ugyan kémiai értelemben nem különbözik az állati szövetek hasonló molekuláitól, a növényi szilárdítóelemek jelenléte mégis sokkal agresszívebb feltárást igényel és a kinyerhető RNS várható mennyisége is kevesebb azonos tömegű mintát tekintve. Számos kinyerési eljárás és gyári kit létezik a különböző növényfajok, szövetek és szervek nyújtotta eltérő kihívásokhoz optimalizálva, így nincs egy általános procedúra, amely minden növényi mintához alkalmas lehetne.

A növényi sejtfal fontos sejtalkotó, amely alapvető védelmi szereppel bír a sejtek és a szervezet szintjén egyaránt, de a víz, az ásványi anyagok és számos egyéb vegyület forgalmában is alapvető jelentőségű. Kísérleti szempontból a sejtfal nyilvánvaló akadályt jelent a makromolekulák kinyerésében, vagy bármilyen anyagnak (génkonstrukciók, siRNS-molekulák, stb.) a növényi sejtbe való bejuttatásában. Az érett növényi sejt sajátossága a nagy, központi, folyadékkal telt vakuólum, amelyet a sejtplazmától a tonoplaszt határol. Molekuláris biológiai szemszögből a magas víztartalom gyakran együtt jár a fajlagosan kisebb nukleinsav-tartalommal. A zöld szövetek nagyszámú kloroplasztiszt is tartalmaznak, amelyek a mitokondriumokhoz hasonlóan saját genommal és a róluk kifejezett transzkriptumokkal rendelkeznek. Az RNS kinyerése során a plasztiszok – akárcsak a mitokondriumok – széttörnek és számottevő mRNS- és rRNS-tartalmuk a környezetbe kerül és gélelektroforézis során is feltűnő sávokat eredményezhet (9.5. ábra), amelyekkel az állati RNS-kivonat esetében nem találkozunk. Az élő sejt RNS-tartalmának ~80%-a rRNS, kb. 10-15%-a tRNS, míg az mRNS-ek aránya kb. 2-3, de max. 10%. Az rRNS dominanciája miatt az RNS-kivonat épsége is a két legjobban feltűnő rRNS-típus, a sejtmagi 18S és 26S rRNS (9.1. táblázat) alapján becsülhető (9.5. ábra).

9.1. táblázat. A búza sejtmagban, kloroplasztiszban és mitokondriumban kódolt rRNS-típusai és méretük (nu: nukleotid)

Sejtmagi

Plasztisz

Mitokondriális

név

méret (nu)

név

méret (nu)

név

méret (nu)

5 S

120

4,5 S

95

5 S

122

5,8 S

164

5 S

121

18 S

1955

18 S

1810

16 S

1492

26 S

3467

26 S

3391

23 S

2888