9.3. Az RNS kinyerése

9.3.1. A kinyerés általános jellemzői

Az RNS kémiailag és biológiailag kevésbé stabil a DNS-hez képest, különösen magasabb hőmérsékleten (>65°C), ill. nehézfémionok jelenlétében. További nehézség a rendkívül ellenálló ribonukleázok (RNázok) aktivitása, amit mindenképpen semlegesíteni kell a kinyeréskor. A magas RNáz-aktivitású biológiai mintákból a szokottnál is nagyobb kihívás a jó minőségű és megfelelő mennyiségű RNS kinyerése. A növényi anyag homogenizálása során megszűnik az organellumok és a vakuólum integritása, az itt tárolt RNázok kiszabadulnak, ezért a különböző kinyerési eljárásokban nagy hangsúlyt fektetnek az RNáz-aktivitás semlegesítésére. Az izolálás során különféle szennyezőanyagok is maradhatnak a kivonatban, amelyek akár nyomnyi mennyiségben is befolyásolhatják az RNS további felhasználását. Az RNS-t felhasználó kísérleteket alaposan meg kell tervezni és a kivonatot a lehető leghamarabb fel kell használni!

Több hatékony RNS-kinyerési eljárást dolgoztak már ki és mindegyiknek tovább finomított, ill. a különböző RNS-típusokhoz optimalizált formája is elérhető különböző publikációkban. Függetlenül attól, melyik recept mellett döntünk, érdemes két lépéssel előre gondolkodni és figyelembe venni, mi lesz a tisztított RNS sorsa, milyen további mérésekben, reakciókban kívánjuk felhasználni?

A kinyerés legfontosabb részletei:

  1. A membránok (és a növények esetében a sejtfalak) felszakítása egy megfelelő módszerrel. Az első lépés a sejtek feltárási módjának meghatározása, ill. a szükséges RNS-populáció kiválasztása. Különböző lízis pufferek lehetnek alkalmasak pl. sejttenyészet, állati szövet, vagy egy növényi mag RNS-ének kinyeréséhez. A DNS korai elválasztása és a sejtszervecskékben levő RNS különválasztása szintén olyan igények, amelyek befolyásolják ezt a lépést.

  2. A nukleázok aktivitásának megszüntetése. Az RNázok gátlása alapvető fontosságú, ezért egyrészt minden alkalmazott eszköz és reagens tisztaságáról gondoskodni kell, másrészt a feltárt sejtnedv RNáz enzimeit is minél előbb hatástalanítani kell. A kinyerés további lépései során is mindig szem előtt kell tartani az RNázok aktivitásának kiküszöbölését.

  3. A minta fehérjéinek eltávolítása. A fehérjék tökéletes eltávolítása nem csak az RNáz-aktivitás megelőzése miatt alapvető jelentőségű, de mind DNS-, mind RNS-kivonat esetében a további reakciókat és vizsgálatokat is erősen zavarhatják a kivonatban maradó szennyező fehérjék, hiszen kapcsolatba léphetnek a nukleinsavval, ill. egyéb reagensekkel.

  4. A nukleinsav koncentrálása. Ez a legtöbb RNS-kinyerési eljárás utolsó lépése, ami többnyire a nukleinsav kicsapását jelenti sók és alkohol különböző kombinációjának felhasználásával (9.2. táblázat). A különféle sók komplexet képeznek a nukleinsavakkal és jelentősen csökkentik oldhatóságukat etanolban és izopropanolban, ezt pedig tovább lehet fokozni a hőmérséklet csökkentésével, amire az RNS kinyerésénél szükség is van.

  5. A tisztított RNS tárolása. Mivel az RNS kémiailag jóval kevésbé stabil, mint pl. a DNS, a helytelen tárolás viszonylag gyorsan a degradációját okozza.

Négy fő kísérleti körülményt kell elkerülni az RNS-sel való munka során: 1) a lúgos kémhatású közeget, 2) a magas hőmérsékletet, 3) a fém-, különösen a nehézfémionok jelenlétét és 4) az RNázok jelenlétét, ill. aktivitását. A megfelelő közeg semleges, vagy enyhén savas, így el lehet kerülni a ribóz 2’OH-csoport nukleofil aktivitását, amely az RNS-lánc töredezését okozhatná. A magas hőmérséklet hasonló okból kerülendő, így végig 0-4°C között (azaz pl. jégen) érdemes végezni a kinyerést. A káros fémionok pl. ioncserélő gyanta használatával távolíthatók el a felhasznált oldatok készítése során. A másik lehetőség 0,1 M EDTA alkalmazása az oldatokban, amely komplexbe viheti a fémionokat.

Az RNS-t bontó RNázok származhatnak a biológiai mintából, ahol eredetileg nem férnek hozzá szubsztrátjukhoz, de a homogenizálás hatására az enzim és az RNS találkozik és a reakció azonnal elindul. Ezért a minta feltárásakor erős denaturáló reagenst használnak, ami természetesen nem csak az RNázokat denaturálja, hanem megszünteti az RNS-fehérje kölcsönhatásokat és az RNS másodlagos stb. szerkezetét is. Ha ezek megtartása fontos lenne, specifikusabb RNáz-inhibitort érdemes használni, mint pl. a vanadil-ribonukleozid komplexek, a heparin, vagy különböző peptid RNáz-inhibitorok. Az RNázok kívülről is a mintába kerülhetnek, akár közvetlen biológiai forrásból (korábbi mintákból, vagy a munkát végző személyekről), akár az egyéb laboratóriumi munka során alkalmazott RNS-mentesítési eljárásokból, ahol többnyire RNáz A használatos, amely rendkívül ellenálló a magas hőmérséklettel és a kémiai kezelésekkel szemben is. Az ilyen szennyeződés elkerülhető egyszer használatos eszközök alkalmazásával, a nem eldobható eszközök alapos sterilizálásával, elővigyázatos steril munkával és az RNáz A egyéb, kevésbé agresszív RNázokkal való helyettesítésével (pl. RNáz T1). Mivel az RNázok származhatnak a kézről is, alapszabály az eldobható gumi-, vagy latexkesztyű viselése és nagyon jó szolgálatot tehet – ha van rá mód – a szűrőbetétes pipettahegyek használata is.

Ha az endogén RNázok aktivitásának megelőzésére megtettük a szükséges lépéseket, általában nincs szükség RNáz-inhibitorok alkalmazására. Ugyanakkor sok recept ajánlja a kinyerés és a további alkalmazások során használt vizes oldatok kezelését a dietil-pirokarbonát (DEPC) nevű vegyszerrel, amelyről ismert, hogy reakcióba lép az aminokkal, így semlegesíti az RNázokat is. A kezelés során a víz, ill. vizes oldat DEPC-tartalmát 0,1%-ra állítják be és 37°C-on 12 órát hagyják hatni, majd 100°C-os, 15 perces főzéssel, vagy autoklávozással távolítják el a reakcióban részt nem vett molekulákat. A DEPC azonban nem csak a fehérjékkel reagál, hanem az adenozin nukleotidokat is módosíthatja, vagyis károsíthatja az RNS-t, ezért használatát az utóbbi időben mellőzik. Egy másik gyakori megoldás az RNS védelmére a fehérjetípusú emlős RNáz-inhibitorok használata, amelyek gátolják az RNáz A, B és C enzimeket (de sok más RNázt nem). Ezek az inhibitorok az említett RNázokkal 1:1 arányú, nem kompetitív kötést alakítanak ki, viszont denaturációjuk vagy oxidációjuk hatására a kötés megszűnhet és az inaktivált RNázok felszabadulva újra működésbe léphetnek.

9.3.2. A minta feltárása és a makromolekulák denaturációja

A növényi RNS kinyerésekor az első feladat a sejtfal minél alaposabb megbontása, amelyet elsősorban folyékony nitrogénes eldörzsöléssel, ill. kézi, vagy elektromos törő szerkezettel oldanak meg. Utóbbihoz gyakran alkalmaznak kemény anyagból (pl. volfrám-karbid) készült apró gyöngyöket és hozzávaló rázókészüléket, de a folyékony nitrogénes fagyasztással is kombinálható sok gépi technika. Míg a puha szövetek többnyire könnyen homogenizálhatók fagyasztás nélkül is, a növényi minták többségénél e lépés nem hagyható el a kinyert RNS mennyiségének jelentős csökkenése nélkül (9.1. ábra).

9.1. ábra. Az ábra három részre tagolva mutatja a paradicsom levelekből származó minta megfagyasztását folyékony nitrogén segítségével és a mozsárban való eldörzsölés utáni állapotát

9.1. ábra. Paradicsom levélminta feltárása folyékony nitrogénnel, mozsárban

Az összes eljárás természetesen a sejtek feltárásával kezdődik, amelyhez a mechanikai hatáson túl alapvetően kétféle puffer használatos: 1) a durva membránbontó és denaturáló ágenst tartalmazók, amelyek szétroncsolják a membránokat és egyúttal inaktiválják az RNázokat; ill. 2) a plazmamembránt finoman megbontó, pl. nem-ionos, hipotóniás pufferek, amelyek a sejtalkotók integritását nem befolyásolják. Ez utóbbiak azonban a sejtfallal rendelkező sejteknél nem használhatók, így a növényi RNS kinyerésekor is jellemzően az előbbi típust alkalmazzák.

A kivonó pufferekben alkalmazott leggyakoribb durva membránbontó és denaturáló anyagok a következők: 1) guanidiniumsók; 2) Na-dodecil-szulfát (SDS); 3) szarkozil (Na-lauril-szarkozinát vagy Na-dodecil-szarkozinát); 4) cetil-trimetil-ammónium-bromid (CTAB); 5) fenol; 6) kloroform; 7) urea.

  1. A guanidiniumsók. A guaninból származtatható guanidin élettani körülmények között protonálódik és guanidinium kation jön létre, amelyet guanidiniumsók létrehozásához használnak. A legismertebb formák a -klorid, -hidroklorid és -tiocianát sók. E vegyületek a legerősebb denaturálószerek közé tartoznak, a nukleinsav-kinyerésben manapság oly gyakran alkalmazott TRI® reagensek alapanyagai.

  2. SDS, szarkozil. Anionos detergensek, erős denaturáló tulajdonsággal, ezért gyakran alkalmazzák őket makromolekulák elválasztása, pl. elektroforézis során.

  3. CTAB. Kationos detergens, elsősorban a DNS kinyerése során használják, de RNS-kivonásban is használatos, pl. növényi mintáknál, ahol a magas polifenol- és/vagy poliszacharid-tartalom miatt más pufferek kevésbé hatékonyak.

  4. Fenol és kloroform. A legtöbb hagyományos DNS- és RNS-kinyerési eljárás alapjai, ma már sokszor nem elsősorban a feltáráshoz, hanem a fehérjék eltávolításához használják.

9.3.3. A fehérjék eltávolítása és az RNS tisztítása

Az RNS kinyerésénél alapvető a fehérjék eltávolítása, amelyet fenollal, vagy proteáz enzimekkel oldanak meg. A legtöbb fehérje denaturálódik a vizes fenolban és fázisszétválás után oldódik a fenolos fázisban, vagy mindkét fázisban oldhatatlan lévén, a vizes és a fenolos fázis között oldhatatlan hártyaként megjelenő interfázist képez. Az RNS ilyenkor, centrifugálás után a felső, vizes fázisból etanollal kicsapható. A tiszta fenol helyett gyakran fenol-kloroform elegy használatos, mivel ez még jobban denaturál és megakadályozza a poli(A)+ mRNS-ek oldódását a fenolban, ami bizonyos körülmények között megtörténhet. A fázisok szétválása kis mennyiségű izoamil-alkohol hozzáadásával segíthető, mivel fokozza a felületi feszültséget a fázisok határán. A fenol oxidációját pirosas, rózsás elszíneződés jelzi, az ilyen oldat már nem használható, viszont megelőzhető a sárgás színt kölcsönző 8-hidroxikinolin hozzáadásával, amely megelőzi a vizes fenol oxidációját. Az említett fehérje interfázis jelentős mennyiségű nukleinsavat is visszatarthat, amit egy második extrakciós lépésben érdemes lehet kinyerni belőle. A gyakorlatban a fehérjék tökéletes eltávolítása megkövetelheti a Mg2+ és Ca2+ ionok előzetes eltávolítását EDTA segítségével, a fehérjék kicsapásához pedig gyakran használnak ionos detergenst (pl. SDS), vagy erősen denaturáló vegyületet (pl. guanidinium-tiocianát). A fenolos kinyerés előtt szintén gyakran alkalmazzák a fehérjék lebontására a proteináz K emésztőenzimet, amelyet később pl. SDS-sel denaturálnak. A fenolos kinyerésnél a sókoncentráció, a kémhatás és a hőmérséklet beállítása is fontos. Ha a sókoncentráció kellően magas, az összes RNS a vizes fázisba kerül. A DNS kinyerése során a pH 7 fölött tartandó, mert semleges kémhatású közegben a DNS hajlamos interfázisba kerülni, pH 7 alatt pedig a fenolos fázisban oldódik. Az RNS-ek nagy részének oldódási tulajdonságait nem befolyásolja ennyire a kémhatás, ezért pH 7 alatt DNS-szennyeződéstől mentesen szelektíven izolálhatók. A poli(A)+ mRNS-ek viszont részlegesen oldódnak a fenolos fázisban pH 7,6 alatt és kinyerésükhöz javasolt a fenol-kloroform(-izoamil-alkohol) elegy pH 5-9 között, vagy a fenol pH 9 kémhatással.

A módszer sikerét alapvetően befolyásolja a kiindulási minta tömegének és az alkalmazott puffernek az aránya. Logisztikailag érdemes lehet koncentráltan tartani a mintát és mikrocentrifuga csövekben dolgozni, mint nagyobb méretekben. Újabban a guanidinium- és/vagy ammónium-tiocianát pufferek és a savas fenol kombinációja is előfordul a receptekben. A kombináció előnye lehet a több szerves komponens eltávolítása, így magasabb A260/A280 arány (9.4. ábra, 9.3. táblázat), azaz tisztább kivonat érhető el.

A vizes fázis levétele némi gyakorlatot igényel, hiszen ahogy csökken a térfogata, egyetlen cseppé ugrik össze. Érdemes a pipettahegyet a fenolos és az interfázistól legtávolabbi ponton a cső falához vezetve kinyerni (9.2. ábra).

9.2. ábra. Az ábra egy mikrocentrifuga cső keresztmetszetét mutatja, benne a fenolos fázis, az interfázis és a vizes fázis elkülönülését és a vizes fázis kinyerését a megdöntött cső felső falához illesztett pipettahegy segítségével

9.2. ábra. A fehérjék eltávolítása során a vizes fázis elkülönítése a fenolos (szerves) fázistól és az interfázistól.

Egy másik lehetőség, ha a felülúszó kb. 90%-ának levétele után a szerves fázist távolítjuk el alóla úgy, hogy csak egy csepp maradjon belőle. Az ezt követő centrifugálás után a vizes fázis maradéka már könnyen eltávolítható.

9.3.4. Az RNS koncentrálása

Az RNS kinyerése a tisztított vizes oldatokból etanolos kicsapással történik. Megfelelően magas ionerő mellett (0,2 M NaCl, 0,3 M Na-acetát, 0,8 M LiCl, vagy 2-2,5 M NH4-acetát) a minimális kicsapható mennyiség kb. 20 ng/ml. Hígabb oldatokból való kinyeréshez, ill. a kis molekulatömegű RNS-ek hatékony megtartásához a kicsapást segítő egyéb anyagokra is szükség van. A hagyományos recept szerint 0,3 M Na-acetátos oldatból 2,5-3 térfogat (tf) hideg 96%-os etanollal kicsapható az RNS. A hőmérséklet csökkentésével (pl. 5 perc szárazjégben, ill. 15 perc -20°C-on, vagy jégen) és az idő növelésével a kinyert RNS koncentrációja növelhető, ill. a kisebb molekulák is megtarthatók. A csapadékot ilyenkor centrifugálással gyűjtik össze (12000 g, 15 perc, 4°C), a kis fragmentek visszanyeréséhez, ill. alacsony RNS-koncentráció esetén a centrifugálási időt és fordulatszámot növelni lehet. A csőből az etanolt maradéktalanul el kell távolítani. A csapadékban és a cső belső felületén szennyeződésként jelenlevő sókat egyszeri, vagy többszöri mosással távolítják el, ami történhet 70%-os etanollal, ill. 70%-os etanol és 0,25 M NH4-acetát keverékével. Ha a csapadék a mosás közben elmozdul a cső aljáról, rövid centrifugálással ülepítik vissza. A mosófolyadékot szintén maradéktalanul és gyorsan el kell távolítani, pl. 65°C-on 5-10 percig melegítve, vagy steril fülkében nyitva hagyva a kiszáradás elősegítése végett. Az etanolos kicsapás során különböző sók használatosak az elérendő cél függvényében (9.2. táblázat). A leggyakrabban használt só a Na-acetát (NaOAc; 0,3 M, pH 5,2), míg NaCl (0,2 M) ajánlott, ha a minta SDS detergenst tartalmaz, mert a konyhasó elősegíti az SDS oldódását a 70%-os etanolban. Ha a kicsapás nagy mennyiségű etanolt kíván, gyakran használnak LiCl sót (0,8 M), mert igen jól oldódik etanolos oldatokban, így nem csapódik majd ki a nukleinsavval együtt. Ha kizárólag a nagyméretű RNS (rRNS és mRNS) megtartása a cél, akkor a kicsapást nem etanollal végzik, hanem a LiCl-koncentráció 0,8 M-ra emelése után a mintát jégen hagyják 2 órát, majd centrifugálással (15000 g, 20 perc, 0°C) ülepítik a nagy RNS-molekulákat. A sót ezután el kell távolítani, mert a LiCl zavarhatja az ezt követő reakciók némelyikét, pl. a reverz transzkripciót.

A szabad nukleotidok kicsapódását 2-2,5 M NH4-acetáttal lehet megakadályozni, az ammóniumionok viszont zavarhatják pl. a fág-típusú T4 polinukleotid-kináz működését a későbbi reakciók során.

9.2. táblázat. Só-alkohol kombinációk a nukleinsavak kicsapásához*

A törzsoldat koncentrációja

Szükséges mennyiség

Végkoncentráció

NaOAc

3 M, pH 5,2

0,1 térfogat

300 mM

NaCl

1 M

0,1 térfogat

200 mM

LiCl**

8 M

0,1 térfogat

800 mM

NH4OAc***

10 M

0,2 térfogat

2 M

KOAc

2,5 M

0,1 térfogat

250 mM

 

Alkohol

A só hozzáadása után szükséges mennyiség

Etanol (95–100%)

2,2–2,5 térfogat

Izopropanol (100%)

0,6–1,0 térfogat

*A küszöbértékek: DNS – 50 ng/ml, RNS – 100 ng/ml. Ha az oldatok ennél hígabbak, a kicsapás egyéb segédanyag nélkül nem megy végbe hatékonyan.

** A LiCl nem csapódik ki a nukleinsavakkal együtt, mindazonáltal kerülik a használatát, ha az RNS-t reverz transzkripcióban kívánják később felhasználni.

***A cDNS kicsapása során a legkedveltebb só, mert megakadályozza a szabad nukleotidok csapadékba kerülését.

9.3.5. mRNS-ek és kis RNS-ek kinyerése

Az mRNS-eket leggyakrabban az összes RNS-t tartalmazó kivonatból tisztítják tovább, de léteznek eljárások, amelyek már a kinyerés elején elkülönítik őket az egyéb komponensektől. A kis RNS-ek iránti érdeklődés az utóbbi években nőtt meg, mióta számos típusuk szerepe tisztázódott a transzkripció utáni és egyéb szabályozó folyamatokban.

A kis RNS-ek megtartásához alkalmas kinyerési eljárás megegyezik a fentiekkel: lízis és denaturáció, extrakció és végül az RNS kicsapása. Erős denaturálószert (pl. guanidinium) és sokszor ezzel együtt erős redukálószert (pl. 2-merkaptoetanol) adnak a mintához a lízis közben/után, hogy meggátolják az RNázok aktivitását és megtartsák az RNS integritását. A denaturáló közeg megszünteti a diszulfid-hidakat, a redukáló ágensek pedig megakadályozzák a polifenolok oxidációját, ami nagy veszteséget okozna a nukleinsavak oldhatatlan állapotban való megkötésével. A merkaptoetanol (és hasonlóan a ditiotreitol, DTT) szintén képes megszüntetni a diszulfid-hidakat.

Az extrakció során fenol, savas fenol, vagy kloroform a leggyakrabban használt szerves oldószer. Az ezt követő centrifugálás után az RNS elválasztható a DNS-től és a fehérjéktől. Végül a felső, vizes fázisból a nagy és a kis RNS-ek egyaránt kicsaphatók alkohollal. Az ioncserélő és szilikon alapú technikák (pl. Qiagen RNeasy spin column) a növények esetében sokszor nem alkalmasak a 200 nu alatti RNS-ek, így a miRNS frakció hatékony elválasztására. A gyakran használt LiCl-os kicsapás sem megfelelő a kis RNS-ek megtartására, helyette érdemes nátriumsót és/vagy alkoholt alkalmazni.

Az mRNS-ek a sejt RNS-tartalmának mindössze 2-3%-át teszik ki, így szelektív dúsításuk megnöveli a statisztikai valószínűséget egy vagy több mRNS megtalálhatóságához egy adott mintában. A dúsítás során igyekszünk megtartani az mRNS-eket és megszabadulni a többi típustól. Így pl. 1) növelhető a transzkripciót vizsgáló módszerek érzékenysége (Northern analízis, nukleázos emésztés, RT-PCR), ill. 2) abszolút reprezentatív cDNS-könyvtár készíthető. A megtalálhatóság statisztikai növelésével a ritka mRNS-molekulák is könnyebben azonosíthatók. Az mRNS-frakció izolálásának azonban hátulütői is vannak: a szelekció egyes ritka transzkriptumok arányának csökkenésével is járhat és veszélyeztetheti az adatok megbízhatóságát.

Az mRNS-ek szelekciójának alapja szinte minden esetben a poli(A)-farok kötése oligo(dT)-szekvenciához. Azonban fontos tudni, hogy bár a legtöbb eukarióta mRNS rendelkezik e jellegzetességgel, egy kis részüknek nincs poli(A)-farka, így az ezen alapuló szelekcióval csak a poli(A)+ mRNS-ek maradnak meg, a poli(A)- mRNS-ek elvesznek. Utóbbiak jóval ritkábbak, de vannak olyan gének, amelyeknek mindkét típusba tartozó transzkriptumai is lehetnek.

Az oligo(dT) elemek alkalmazása hosszú múltra tekint vissza. Míg korábban latex, ill. cellulóz hordozóhoz csatolták őket és ehhez kötötték ki a poli(A)+ mRNS-molekulákat, az utóbbi időben 1) biotinhoz kötik az oligo(dT) elemeket és az avidin-biotin kötés kihasználásával szelektálják az mRNS-t, ill. 2) mágneses gyöngyökhöz kötött oligo(dT) láncokra kötik a poli(A)+ mRNS-molekulákat és mosással távolítják el a többi nukleinsavat (9.3. ábra).

9.3. ábra. Az ábra folyamatában mutatja a poli(A)+ RNS dúsítását mágnesgyöngyös módszerrel. Az A-T kötések kihasználásával és a sókoncentráció változtatásával a kikötött poli(A)+ RNS tisztítható, majd leoldható és eltávolítható a gyöngyöktől.

9.3. ábra. A poli(A)+ RNS dúsítása mágnesgyöngyös módszerrel. A nyers sejtkivonatot, vagy a tisztított RNS-t magas sókoncentráció mellett oligo(dT) láncokat hordozó mágnesgyöngyökkel keverik össze. Az A-T kötések kialakulása után a kikötött poli(A)+ RNS tisztítható, majd a sókoncentráció csökkentésével leoldható és eltávolítható a gyöngyöktől.