9.4. A kivonat ellenőrzése

Minden vizsgálatnál, amelyhez tisztított RNS-re van szükség, erősen ajánlott a kinyert RNS mennyiségének és minőségének ellenőrzése. Maga a kinyerés is idő- és költségigényes, de ez fokozottan igaz az RNS-t felhasználó alkalmazások többségére, így fontos ismerni a kivonat mennyiségi és minőségi jellemzőit. Az ellenőrző vizsgálatot rögtön az RNS kinyerése után el kell végezni, amennyiben pedig az RNS-t hosszabb (vagy akár rövidebb) ideig tároljuk, közvetlenül a felhasználás előtt szintén érdemes megvizsgálni, hiszen különösen érzékeny molekuláról van szó.

9.4.1. UV-spektrofotometria

A nukleinsavak mennyiségi meghatározásához leggyakrabban a 260 nm-en mért elnyelési értéket szokták figyelembe venni. Ez a legegyszerűbb, leggyorsabb és legelterjedtebb módszer a kitermelés, a tisztaság és a valószínű felhasználhatóság megállapítására. A tiszta nukleinsavak jellegzetes elnyelési profilt mutatnak 230 és 320 nm között (9.4. ábra). 320 nm-nél a tiszta nukleinsavmintának nincs már elnyelése. A normális görbétől való eltérés szennyezők jelenlétére utal, amelyeknek természetére a görbe módosulásának helyéből következtethetünk. Az elnyelés egyenesen arányos a minta RNS-tartalmával, amelynek ismerete elengedhetetlen pl. a helyes enzim : primer : RNS-templát arány beállításához, ami viszont a hatékony reverz transzkripció alapja. A nukleinsavak abszorpciós maximuma 260 nm-nél látható. Az elnyelés mértékéből a koncentráció a következő egyenlet alapján számítható:

μg RNS / ml = A260 × hígítás × 40

ahol

A260 = elnyelés (abszorpció, optikai denzitás) 260 nm-nél (OD260)

hígítás = a hígítás mértéke, pl. tízszeres hígításnál 10

40 = az RNS átlagos extinkciós koefficiense (40 μg / OD260)

A pontos érték függ az RNS elsődleges és másodlagos szerkezetétől és a pH-tól, ill. közvetett módon az ezeket befolyásoló tényezőktől (ionerő, ionok típusa, EDTA, ill. denaturálószerek jelenléte, hőmérséklet). A kettős szálú DNS koncentrációja hasonlóan számolható (50 μg / OD260), de mivel a timin és az uracil extinkciós koefficiense különbözik, a DNS-szennyezett RNS-oldat, ill. az RNS-szennyezett DNS-kivonat elnyeléséből helytelen adat számolható.

A 0,1 OD alatti elnyelés főként a régebbi típusú spektrofotométereken hamis eredményt adhat, így ha hígítás miatt lett ilyen kicsi a kivonat elnyelése, érdemes töményebb oldatot mérni. Gyakorlati probléma lehet az UV-spektroszkópia alkalmazása során a mérendő RNS kis mennyisége. Az elnyelés pontos meghatározásához – egy átlagos fotométer esetében – 5 μg/ml fölött kell lennie az RNS töménységének, ami a szokásos küvettákat használva min. 4 μg. Ez a mennyiség nem feltétlenül áll rendelkezésre, ilyenkor hasznos lehet a mikroküvetta, amellyel már 7 μl mintát is meg lehet mérni. Egy másik, modernebb lehetőség az ún. cseppfotométerek (pl. NanoDropTM) használata, amelyek nem küvettában, hanem két száloptika között kifeszített egyetlen cseppben mérik egy adott oldat elnyelési tulajdonságait. 0,5-3 μl minta elegendő a méréshez, ami nem elhanyagolható előny egy 20-60 μl végtérfogatú nukleinsav-kivonat esetén. A készülék a mérés után a 220 és 350 nm közötti spektrumot is kirajzolja, ill. a helyes beállítás mellett ng/μl (= μg/ml) mértékegységgel azonnal kijelzi a minta RNS-tartalmát is (9.4. ábra).

9.4. ábra. Az ábra egy növényi RNS-kivonat fényelnyelését mutatja 220 és 350 nm hullámhosszok között és megjeleníti az elnyelési adatokat 230, 260 és 280 nm hullámhosszoknál, illetve ezen elnyelési adatok hányadosait

9.4. ábra. Növényi RNS-kivonat UV-spektrofotometriai vizsgálata NanoDrop fotométerrel. A: az elnyelési spektrum 220 és 350 nm között és az elnyelési alapadatok; B: táblázatos riport a készülék programjából a fenti adatokkal.

A mennyiségi meghatározást leginkább a szennyező anyagok nehezítik. Ezek tipikus példái a fehérjék, fenoloidok és kisebb mennyiségben a kinyerés egyes reagensei, mint pl. a 2-merkaptoetanol vagy a DTT.

Az A260 érték azonban önmagában nem sokat mond a minta minőségéről és tisztaságáról, ezért az A260/A280 ésA260/A230 (és esetlegA260/A240) arányokat is érdemes figyelembe venni (9.3. táblázat). A tiszta RNS-kivonat A260/A280 értéke 2,0 ± 0,1, míg az A260/A230 arány 2,0 és 2,4 között van. Az alacsony A260/A280 érték fehérjeszennyezésre utal, míg az 1,5-1,8 alatti A260/A230 arány eredhet guanidinium, merkaptoetanol, vagy egyes sók, ill. speciálisan a növényi mintáknál poliszacharidok jelenlétéből. Az A260/A240 arány 1,4 alatti értéke azt jelezheti, hogy nagyobb mennyiségű só maradt a kivonatban. Ilyenkor érdemes újra kicsapni az RNS-t az oldatból, majd többszöri etanolos mosás után szárítani és újra feloldani a csapadékot.

9.3. táblázat. A nukleinsav-kivonatok tisztaságának ellenőrzése az UV-elnyelés alapján: a helyes és a problémára utaló arányértékek

 

DNS

RNS

Szennyezettségre utaló arány és a szennyezés típusa

A260/A280

1,8

2,0

Az 1,8 alatti arány fehérjeszennyezésre utal

A260/A230

2,0 – 2,4

2,0 – 2,4

Az 1,8 alatti arány poliszacharidok, vagy detergens jelenlétére utal

A260/A240

1,4 – 2,0

1,4 – 2,0

Az 1,4 alatti arány sószennyezésre utal

9.4.2. Agaróz gélelektroforézis

A kinyert RNS agaróz, vagy poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgálható. Ha denaturáló körülmények szükségesek, formaldehidet adnak az agaróz, ill. ureát a poliakrilamid gélhez.

Az RNS integritását, sértetlenségét legegyszerűbben agaróz gélelektroforézis módszerrel ellenőrizhetjük. 1-1,2%-os, denaturáló agaróz gélen futtatva a kivonat néhány μl-es mennyiségét, az rRNS sávok és a háttér tisztasága alapján becsülhető a kinyert RNS épsége. Az elmosódott sávok és a hosszan elnyúló háttérzaj („smear”) az RNS bomlására utal. A teljes bomláskor a sávok eltűnnek és csak nagyon alacsony molekulatömegű „smear” figyelhető meg a gélen. Denaturáló körülmények között az RNS minőségét jól jellemzi a 25-28S és a 18S rRNS sávok aránya: mivel előbbi molekula durván kétszer akkora, mint az utóbbi, így a festék (pl. etidium-bromid) intenzitása is kb. kétszerese a magasabban levő sávban, ha az RNS sértetlen állapotban van.

Növényi mintáknál a sejtmagban kódolt (sm) rRNS csíkok között és alatt megjelennek a kloroplasztisz rRNS-ek – és esetenként mRNS-ek – is, de a sávok sorrendje növényfajtól és a szövet típusától függően változhat (9.5. ábra).

9.5. ábra. Az ábra növényi RNS-kivonatok jellegzetes sávjainak elválását mutatja agaróz gélen. A sejtmagban kódolt (sm) 26S és 18S rRNS-ek mellett megjelennek a kloroplasztiszban kódolt rRNS és mRNS molekulák sávjai is.

9.5. ábra. Növényi RNS-kivonatok elválasztása agaróz gélen. A sejtmagban kódolt (sm) 26S és 18S rRNS-ek mellett megjelennek a kloroplasztiszban kódolt rRNS és mRNS molekulák sávjai is.

A hagyományos módszer modern alternatívája a mikrofolyadék technológia, amely során az elektroforézis miniatürizált formában megy végbe egy apró üveglap („labchip”) felületén. A módszer előnye a nagyobb érzékenység, a minimális mintafogyás és a nagy felbontás. Az eredmény a hagyományos gélszerű kép mellett elektroferogram formájában is megjeleníthető és sokkal pontosabb vizsgálatot tesz lehetővé.

A kisebb RNS-molekulákat denaturáló (7 M urea) poliakrilamid gélen szokták vizsgálni. Ez a módszer (a berendezéstől függően, ill. kb. 150 nu méret alatt) elvileg alkalmas egyetlen nukleotid méretkülönbség feloldására is. Az RNS-gél festésére általában etidium-bromidot használnak, amely UV-megvilágítás (~300 nm) hatására narancs-vörös színben fluoreszkál (~600 nm). Fluoreszcenciája nukleinsavhoz kötve erősen nő, így a háttértől többnyire kimosás nélkül is jól megkülönböztethető.

9.4.3. Egyéb ellenőrzési lehetőségek

Az UV-spektroszkópia egyik alternatívája a fluorometriai vizsgálat, amikor az RNS-hez fluoreszkáló anyagot kötnek. Ilyen pl. a RiboGreen (Life Technologies), amelynek fluoreszcenciája a kötődés után 480 nm-en gerjesztve 520 nm-en mérhető és 1-1000 pg/μl tartományban alkalmazható. A RiboGreen előnye a spektroszkópiával szemben, hogy specifikus az RNS-re, míg utóbbit a DNS-szennyezés zavarja. A RiboGreen emissziója alapján egy standard hígítási sor ismeretében számolható a minta RNS-tartalma.

A PCR tulajdonképpen a minőség ellenőrzésének végső lépése is lehet: ha jó minőségű RNS-kivonaton mindig biztosan működő primerekkel (pozitív kontroll) sem sikerül terméket produkálni az új kivonattal, az biztos jele az adott minta degradációjának, vagy legalábbis használhatatlanságának.