9.6. Egy gyakran alkalmazott kinyerési recept

  1. 0,2 g búzalevelet kb. 0,5 cm-es darabokra vágva folyékony nitrogénben homogenizálunk, majd hozzáadunk 800 μl telített fenol – 0,01 M Trisz-HCl (pH 7,5) – 0,01 M NaCl – 0,1% SDS elegyet, amelyben a fenolos és a vizes fázis aránya 1:1.

  2. Eppendorf csőbe mossuk a homogenátumot, majd centrifugáljuk (10000 g, 10 perc, 4°C).

  3. A felső, vizes fázist tiszta csőbe pipettázzuk át. (Ez az RNS-ből főként a tRNS és rRNS frakciókat tartalmazza)

  4. Hozzáadunk 0,1 térfogat 20 %-os K-acetátot és két térfogat 96 %-os etanolt, majd legalább egy óráig, vagy egy éjszakán át hagyjuk kicsapódni a nukleinsavakat.

  5. Centrifugáljuk a mintát (10000 g, 10 perc, 4°C).

  6. A felülúszót elöntjük és oldjuk a csapadékot 60-90 μl 0,3 M NaCl-oldatban.

  7. Hozzáadunk 24-36 μl 5 %-os CTAB-oldatot és legalább 2 órára 4°C-ra tesszük. (A CTAB csapadékba viszi a nukleinsavakat, míg a növényi mintákban gyakori poliszacharidok és cukor-foszfátok oldatban maradnak)

  8. Centrifugáljuk a mintát (10000 g, 30 perc, 4°C).

  9. Elöntjük a felülúszót és kétszer mossuk a csapadékot 30 μl steril, hideg, ultratiszta vízzel, majd centrifugáljuk a mintát (10000 g, 30 perc, 4°C).

  10. Oldjuk a csapadékot 30 μl 0,3 M NaCl-oldatban, majd újra kicsapjuk 2,5 térfogat 96 %-os etanolban. -20°C-on inkubáljuk 30 percig.

  11. Centrifugáljuk a mintát (10000 g, 10 perc, 4°C), elöntjük a felülúszót és maradéktalanul eltávolítjuk az etanolt.

  12. A csapadékot 10 μl 2 M NaCl-oldattal kezeljük, majd centrifugáljuk a mintát (10000 g, 30 perc, 4°C). Megismételjük ezt a két lépést. Az így kapott felülúszó a tRNS-eket, a csapadék az rRNS-eket tartalmazza, utóbbit 30-50 μl 0,3 M NaCl-oldatban vehetjük fel és fotometriásan, ill. gélelektroforézissel ellenőrizhetjük a minta minőségét.