10. fejezet - DNS kinyerés növényekből

szerző: Dr. Oszvald Mária

Tartalom

10.1. A DNS izolálás
10.2. DNS izolálás lépései
10.2.1. A sejtek/ szövetek feltárása
10.2.2. Fehérje denaturáció
10.2.3. RNS eltávolítása
10.2.4. A DNS elválasztása a fehérjéktől és a további sejtes elemektől
10.3. Egyéb DNS tisztítási módszerek
10.4. DNS mennyiségi meghatározási módszerek
10.5. A gyakorlat menete

10.1. A DNS izolálás

A molekuláris diagnosztikai, kutatási és azonosítási módszerek nagy száma igényel tisztított DNS-t. Az alkalmazott DNS szükséges tisztaságát és mennyiségét a felhasználás módja szabja meg. Ilyen felhasználási lehetőségek pl. a kórokozók detektálása, az emberi genetikai vizsgálatok, GM azonosítások vagy a molekuláris biológiai kutatások.

Az alkalmazott tisztítási eljárások eltérő tisztaságú DNS-t eredményezhetnek, ami meghatározza a felhasználási lehetőségeiket. Bár a PCR (polymerase chain reaction) reakció elvégezhető nyers DNS kivonaton is, az olyan érzékeny reakciók, mint a mennyiségi PCR és a legtöbb diagnosztikai alkalmazás nagy tisztaságú DNS-t igényelnek. A tisztított DNS-ben található szennyeződések ugyanis akadályozhatják a DNS polimerizációt, vagy a DNS restrikciós enzimmel történő hasítását.

A DNS tisztítás kihívásai

A DNS kinyerés fontosabb lépései és az izolálás során felmerülő problémák:

- A DNS molekulák tökéletes elválasztása a többi sejtes komponenstől, mint a fehérjék, lipidek, RNS-ek, de leginkább a poliszacharidok.

- Az endogén nukleázok (DN-áz enzimek) inaktiválása és a genomi DNS molekulák védelme kulcsfontosságú a tisztítási folyamatban. Az endogén DN-áz enzimek gyorsan degradálják a DNS-t, ezért gyorsan és hatékonyan kell őket inaktiválni. A legtöbb esetben az endogén nukleázok inaktiválása hővel, vagy speciális anyagokkal történik.

- A hosszú láncú DNS molekulák fizikai, illetve az endogén nukleáz enzimek okozta töredezettségének elkerülése. A DNS kinyerést lehetőleg friss szövetekből kell megkezdeni. A szövetek (levél, szár, mag) melyek nem kerülnek azonnal felhasználásra fagyasztva tárolhatók. Számos szövet előzetes fizikai kezelést pl. a mechanikus dörzsölés igényel.

- Nagy hozamú DNS kinyerése.