10.2. DNS izolálás lépései

10.2.1. A sejtek/ szövetek feltárása

A DNS izolálás első lépéseként a sejteket és a sejtmagokat fel kell tárni, hogy a DNS molekulák szabaddá váljanak. A legtöbb tisztítási módszer esetében a sejtek feltárása lízis pufferek segítségével történik. Ezek olyan detergenseket és denaturáló szereket tartalmazó pufferek, melyek a sejtmembránok lipid kettős rétegét bontják, ezáltal lehetővé teszik a genomi DNS kijutását a citoplazmába illetve a külső oldatba. A sejtmembránok mellett, a pufferek a citoplazma fehérjéit is denaturálják. Olyan szervezetek, mint a növények is, melyeknek a sejtmembránon túl sejtfallal is rendelkeznek, mechanikai törést illetve további enzimeket is igényelnek a sejtfal hatékony megbontásához, vagy durvább sejtfeltáró eljárást kell alkalmazni (pl. dörzsmozsár, kvarchomok, folyékony N-es fagyasztás)

A következő sejttípusok esetében az alábbi enzimek használatosak a sejtfal megbontásához.

  • Gram-pozitív baktériumok sejtfalának feltárásához lizozim enzim

  • Az élesztők esetében a litikáz enzimek.

  • A növényi sejtek DNS kinyerése során celluláz enzimet vagy durva homogenizálást (ld. fent) alkalmaznak.

A minta fehérjeszerkezetétől függően a detergensek lehetnek denaturálók és nem denaturálók. A denaturálók között is megkülönböztetünk anionos (SDS) és kationos (etil(trimetil)ammónium bromid) detergenseket. Ezek teljesen feloldják a membránt és denaturálják a fehérjéket a fehérje-fehérje kötések felbontásával. Ez megváltoztatja a fehérje konformációját, aminek következtében a fehérjék funkciójukat veszítik. A nem denaturáló detergensek az ún. nem ionos detergensek csoportjába tartoznak. Ilyen hatása van a Triton X-100, vagy a CHAPS kemikáliáknak.

10.2.2. Fehérje denaturáció

A denaturáció a fel nem tekeredett fehérjék konformációjának, a másodlagos szerkezetének megváltozása úgy, hogy az aminosavak közötti peptidkötések nem sérülnek. A fehérje denaturáció következtében a fehérjék oldhatósága csökken, elveszítik biológiai aktivitásuk, a proteáz enzimek aktivitása növekszik, a kromoszómális DNS elválik a nukleoprotein komplexről. DNS-kinyerés során a fehérjéket már a sejtmembrán lizálására alkalmazott detergensek is denaturálhatják (ld. fent), de más denaturáló szerek alkalmazása is szükséges lehet:

  • karbamid, vagy a guanidine a hidrogén kötések felszakítására

  • redukáló szerek a diszulfid hidak bontásához

  • töltéssel rendelkező csoportokat tartalmazó sók, melyek alacsony vagy mérsékelt koncentrációban növelik a fehérjék oldhatóságát

  • hőkezelés a nem poláris és hidrogén kötések bontására

  • egyéb anyagok: EDTA, Mg2+

Denaturáció helyett a fehérjék proteináz-K emésztéssel is eltávolíthatók a lizátumból.

10.2.3. RNS eltávolítása

A DNS izolálás folyamatának további lépése az RNS-ek eltávolítása a DNS mellől. Az RNS-ek lebontásának egyik leghatékonyabb és leggyakoribb módszere az RNS lebontására alkalmazott RN-áz enzim. Az RN-áz enzimmel történő kezelés a DNS extrahálási folyamat mosási lépései közé iktatható be.

10.2.4. A DNS elválasztása a fehérjéktől és a további sejtes elemektől

A nukleinsavak elválasztása a citoplazma többi sejtes elemétől többféle módon történhet.

Szerves oldószerrel

A szennyező RNS és fehérje eltávolítása történhet fenol/ kloroform/ izoamilalkoholos (25/24/1) extrakcióval. A fenol denaturálja a fehérjéket és azért használják kloroformmal együtt, mert a fehérjementesítés hatékonyabb, ha két különböző szerves oldószerrel végzik. Az izoamilalkohol a fenolos szerves és a DNS-t tartalmazó vizes fázis tökéletesebb szétválását teszi lehetővé. Egyes protokollok a fenol/ kloroform/ izoamilalkoholos extrakció után egy extra kloroformos lépést tartalmaznak, ez a fenol nyomokat távolítja el a vizes nukleinsavak oldatból.

Veszélyek

A fenol tartalmú oldatok szembe, bőrre, ruhára ne kerüljenek! Fenolozáskor a gumikesztyű használata kötelező! A csöveket gondosan zárjuk le! A kloroform erősen illékony, ezért pipettázása nehéz, fokozottan tűzveszélyes, nagyobb mennyiségben belélegezve bódító hatású. A centrifugálást kiegyensúlyozott rotorral a szabályoknak megfelelően végezzük!

Kisózás

A nukleinsavak hidrofób tulajdonságúak a negatív töltéssel rendelkező foszfát csoportnak köszönhetően. A sókban található pozitív töltésű ionok kapcsolatba lépnek és semlegesítik a negatívan töltött foszfát csoportokat a DNS molekulán, növelve ezzel a molekula oldhatóságát. A magas sókoncentrációjú közegben a fehérjék dehidratálódnak, elveszítik oldhatóságukat és kicsapódnak. Rendszerint a nagy koncentrációjú nátrium-klorid, kálium vagy ammónium acetát a legalkalmasabbak a kisózásra. A kicsapódott fehérjék centrifugálással távolíthatók el. A DNS a felülúszóban marad, melyet etanollal lehet visszanyerni (kicsapni) az oldatból.

Szilárd anyaghoz kötött szelektív DNS kötő oszlopok

A legtöbb modern DNS tisztítási eljárás olyan tisztítási módszeren alapul, ahol a DNS-t a nyers sejt lizátumból szelektíven valamilyen anyaghoz kötve választják el. Ilyen lehet a szilícium dioxid, vagy az anion-cserélő gyanta (10.1. ábra). Előnyei, hogy gyors, kényelmes, szerves oldószerektől mentes, automatizálásra/minimalizálásra alkalmas.

Növényi DNS izolálás lépései a kereskedelmi forgalomban kapható anion cserélő oszlopot tartalmazó kit segítségével

10.1. ábra Növényi DNS izolálás lépései a kereskedelmi forgalomban kapható anion cserélő oszlopot tartalmazó kit segítségével. A két sorban ábrázolt folyamatábra az egymást követő lépéseket mutatja be.

Szilícium dioxid oszlop:

  • A magas koncentrációjú sók (pl. guanidinium HCl) jelenlétében a DNS szelektíven kötődik a szilícium dioxidhoz, a fehérjék azonban nem kötődnek

  • A lerakódott sók alkoholos oldatokkal eltávolíthatók a membránokról vagy az oszlopokról

  • Alacsony koncentrációjú ionos pufferrel a DNS molekulák leoldhatók a membránról.

Előnye: gyors, automatizálható, centrifugálás nem szükséges (vákuum is alkalmazható), és szerves oldószert nem alkalmaz.

Anion cserélő oszlop (pl. QIAGEN Plasmid Midi Kit)

A DNS molekulában lévő negatívan töltött foszfát csoportok és pozitívan töltött részecskék közötti kölcsönhatáson alapul. A DNS alacsony sókoncentráció jelenlétében kötődik az oszlophoz. A fehérjék és az RNS molekulák közepes sókoncentrációjú pufferekben lemoshatók. A DNS eltávolítása az oszlopról nagy sókoncentráció jelenlétében lehetséges. Az oldatba vitt DNS molekulák etanollal kicsaphatók.

Előnye: Szerves oldószermentes, gyors, de nagyobb felügyeletet igényel és drágább, mint a szilícium dioxid oszlopok.

Mágneses elválasztás (szilícium vagy töltés alapú)

Ebben az eljárásban a DNS-t mágneses részecskéhez kapcsoljuk (10.2. ábra). A mágneses részecskék lehetnek szilícium alapúak. Itt is a DNS kapcsolódása/elengedése a sókoncentráció függvényében történik. Ha mágneses részecskék töltés alapúak, akkor a részecskék töltésének a változása az oldat pH-jának függvényében változik. A negatívan töltött DNS-ek leválnak.

A mágneses részecskékhez kötött nukleinsav (DNS/RNA) izolálási módszer előnye, hogy gyors, szerves oldószer és lecsapásmentes. Könnyen automatizálható.

Mágneses részecskékhez kapcsolt DNS izolálás lépései

10.2. ábra Mágneses részecskékhez kapcsolt DNS izolálás lépései. Az ábra a DNS isolálás egymást követő lépéseit mutatja be a feltüntetett nyilak irányának megfelelően.

A kromatográfiás módszerek komoly hátránya, hogy viszonylag gyenge kihozatal mellett nem alkalmas nagy molekulasúlyú (≥ 50 kb) DNS izolálására, emiatt molekuláris klónozáshoz ill. DNS blothoz más módszereket kell választani.