10.3. Egyéb DNS tisztítási módszerek

Nagy mennyiségű és nagy tisztaságú DNS izolálás CsCl-etídium bromid gradiens centrifugálással

A módszer során először centrifugálással eltávolítjuk a lizátumból a sejtalkotók és fehérjék nagy részét. Ezt követően ultracentrifugálással, CsCl (cézium klorid)- etídium bromid gradiensben történő egyensúlyi centrifugálással választjuk el egymástól az eddig oldatban maradt DNS-t, RNS-t és a szennyeződéseket. A lizátum minden mL-éhez 1 g szilárd CsCl-ot adunk. Ezután minden 10 mL DNS/ CsCl oldathoz 0.8 mL etídium bromidot (10 mg/ml) oldatot keverünk. Az oldatot 8000 rpm-en 5 percig centrifugáljuk, a felülúszót lezárható speciális ultracentrifuga csőbe (Beckman) töltjük és 24 órán keresztül 60 000 rpm-el 20 ºC-on ultracentrifugáljuk. A centrifugálás után a szétvált nukleinsavak UV fényben láthatók. Az RNS a centrifuga cső alján, a lineáris és a zárt cirkuláris DNS-ek feljebb, elkülönülő sávban jelennek meg. Egy injekciós tű segítségével leszívjuk a DNS-t. Az etídium bromidot vízzel telített butanollal eltávolítjuk, a DNS-t tartalmazó oldatot dializáló hüvelyben 24 órán keresztül Trisz-EDTA oldattal szemben dializáltatjuk. Korábban a CsCl-os DNS-tisztítást általánosan használták a génpuskás növényi transzformációhoz szükséges nagyon nagy mennyiségű, és nagy tisztaságú DNS előállítására. Mára a szilícium alapú oszlopok, illetve az anioncserélő oszlopok használata nagyrészt kiszorította ezt a munkaigényes, és az alkalmazott etídium bromid miatt veszélyes módszert.

Cetavlon módszer

Cetavlon (cetyltrimethylammonium bromide, CTA-Br) egy erős kationos detergens, mely segítségével a DNS híg sóoldatokból kicsapható. 1953-ban írták le, hogy a DNS víz-oldhatatlan sókat képez Cetavlon jelenlétében. A nukleinsavaknak ez a tulajdonsága a DNS izolálásra szolgáló Cetavlon módszer alapja. A módszer azt az előnyt használja ki, hogy a nukleinsavak nagy ionerősség jelenlétében is feloldódnak, pl. ha a NaCl koncentráció magasabb, mint 0,5 M. Az összes ismert Cetavlon módszer alkalmazása során a biológiai anyagot Cetavlon oldattal kezelik nagy ionerősség jelenlétében, majd a sejtes törmeléket és a fehérjéket kloroform-izoamilalkoholos extrakcióval távolítják el, végül az ionerősség csökkentésével kicsapják a DNS- CTAB komplexet. Ezután a DNS-t nátrium acetát/etanol elegyben történő mosással nátrium sójává alakítják. A kapott DNS preparátumunk erősen szennyezettek fehérjékkel és RNS-sel, ezért tiszta DNS izolálás további frakcionálást (pl. fenollal kombinált extrakciót) vagy kromatográfiás tisztítást igényel. A módszer alkalmas a DNS 80%-ban történő visszanyerésére a 20-106 Da és nagyobb molekulatömeg tartományban.