11. fejezet - Nukleinsavak elválasztásának módszerei

szerző: Dr. Oszvald Mária

Tartalom

11.1. A gélelektroforézis
11.2. Agaróz
11.3. Váltott elektromos mezejű gélektroforézis (Field Inversion Gel Electrophoresis)
11.4. Feladatok
11.5. Poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE)
11.6. A gyakorlat menete

DNS-fragmentek egymástól való elkülönítésére leggyakrabban elektroforetikus módszereket alkalmaznak, melyek a kromatográfia elvén alapulnak. A kromatográfiás módszereknél álló és mozgó fázist alkalmaznak, ahol az álló fázishoz kevésbé kötődő anyagok gyorsabban haladnak át a rendszeren (eluálódnak). Pl. gélelektroforézisnél a gélben kevésbé elakadó, kisebb méretű molekulák adott idő alatt messzebbre jutnak, mint a nagyok. Az elektroforézis során az egyenáramú elektromos térbe helyezett töltéssel rendelkező molekulák a töltésükkel ellentétes pólus irányában mozdulnak el. A molekulák az elmozdulásuk mértéke alapján azonosíthatók. Az elektroforézis preparatív célra is használható, vagyis a számunkra szükséges fehérje- vagy DNS-molekulát tartalmazó sávot ki lehet vágni a gélből, a molekulákat pedig vissza lehet nyerni belőle.

A nukleinsavak elektroforetikus elválasztása a fehérjéknél egyszerűbb, mert a foszfát csoport miatt töltéssel rendelkeznek, így jól mozognak elektromos erőtérben. Azt, hogy milyen elektroforézist használunk, a DNS fragmentek mérete, az elválasztandó DNS-mennyisége és az igényelt pontosság dönti el:

A) poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE): 500 nukleotidnál rövidebb fragmentek elválasztására használatos és segítségével egyetlen nukleotid pontossággal meg lehet a fragmentek méretét határozni. Régebben DNS-szekvenálásnál is használták.

B) agaróz gélelektroforézis: koncentrációtól függően húsz – több ezer nukleotid hosszú fragmensek elválasztására alkalmas, kevésbé pontos. Egyes speciális alkalmazásainál (pulse field, illetve rotation GE, ld. lejjebb) több MB méretű egész kromoszómák is elválaszthatók. Az agaróz gélelektroforézis a legáltalánosabban használt módszer a DNS-elválasztására, érzékenysége (2 ng már látszik egy fél centis zsebben Etídium bromiddal festve, SYBR Greennel v. Golddal még kevesebb is) a legtöbb laboratóriumi munkához elegendő.

C) Kapilláris elektroforézis (CE): maximum néhány száz bp. hosszú DNS-fagmentek elválasztására alkalmas, akár egy nukleotid pontossággal. Itt egy vékony, belülről töltött részecskékkel borított kvarc kapillárisban áramoltatják az elválasztani kívánt molekulákat, magas feszültséggel. Nagyon pontos, érzékeny (akár 0,1 ng/µL DNS érzékelhető) és jól automatizálható, de drága. DNS-szekvenálásnál, vagy pl. igazságügyi DNS-laborokban PCR-termékek elválasztására használják.

11.1. A gélelektroforézis

Töltéssel rendelkező részecskék elektromos térben töltésüknek megfelelő irányban mozognak. A pozitív töltésű kationok a negatív katód, míg a negatív töltésű anionok a pozitív anód felé haladnak. Az elektródok felületéhez érve az ionok töltésüket vesztik. Elválasztástechnikai szempontból az ionok áramlása az ún. elektroforézis a lényeges; az ionok semlegesítődése az elektrolízis másodlagos kísérőfolyamatnak tekinthető.

A „gél” olyan mátrixot jelent, mely tartalmazza, majd elválasztja a molekulákat. A legtöbb esetben a gél egy keresztkötött polimer, mely összetétele és porozitása a meghatározandó molekula összetételén és méretén alapul.

Kis molekulaméretű nukleinsavak (DNS, RNS vagy oligonukleotidok) elválasztására az akrilamid és a keresztkötő vegyület különböző koncentrációjú keverékéből kialakított eltérő pólus méretű térhálós szerkezetű poliakrilamid gél használható. Nagyméretű nukleinsavak (néhány száz bp-nál hosszabb molekulák) esetében a tisztított agaróz az előnyben részesített elválasztási módszer. Mindkét esetben a gél szilárd, porózus mátrixot alkot. Az akrilamid, a már polimerizálódott formájával, a poliakrilamiddal ellentétben erős idegméreg, ezért megfelelő óvatossággal kell kezelni.

Az elektroforézis során a molekulák elektromos térbe helyezve tömegük/méretük által meghatározott távolságra jutnak el a mátrixban, az elektroforézis ideje alatt.

Alkalmazás

A gélelektroforézis a növényi molekuláris biológiában, genetikában, mikrobiológiában és a biokémiában gyakran használt módszer. A dupla szálú DNS fragmentek a gélben hosszú rúdként viselkednek. Az egyszálú DNS vagy RNS molekulák komplex alakú molekulákká tekerednek fel és harmadlagos szerkezetük alapján egy összetett viselkedés szerint vándorolnak a gélben. Ezért olyan anyagok, mint a nátrium hidroxid vagy a formamid, melyek a hidrogénkötéseket bontják, gyakran használatosak a nukleinsavak denaturációjára. A denaturáció következtében a DNS molekulák ismét hosszú rúdként viselkednek.

A denaturáló agaróz gélelektroforézis rendszerint RNS preparátumok minőségének és méretének az ellenőrzésére szolgál. Az RNS molekulák sok különböző másodlagos szerkezetet alkothatnak, mely befolyásolja a mobilitásukat elektromos térben. Egyik ilyen RNS denaturáló szer a formaldehid, amely denaturált formában tartja az RNS-t. Az elektroforézis után az RNS etídium bromid festékkel vizualizálható. A TBE puffer is denaturálja az RNS-t.

A lúgos agaróz gél alkalmas egyszálú DNS-ek és a cDNS szál méretének az ellenőrzésére.