11.2. Agaróz

Az agaróz egy lineáris agarobióz diszacharid az 1,3 kapcsolt béta-D-galaktopiranóz és 1,4 kapcsolt 3,6-anhidro-alfa-L-galaktopiranóz összekapcsolódásából álló poliszacharid, melyet tengeri vörös algából nyernek. A polimert alkotó diszacharid egység képletét az 11.1. ábra mutatja.

Az agarobióz szerkezeti képlete

11.1. ábra Az agarobióz szerkezeti képlete. A molekula az agaróz polimert felépító alegység molekulát mutatja.

Az agaróz gél agarózból és az elektroforézis pufferből áll össze. Az agar-agar (agaróz) melegítés hatására feloldódik az elektroforézis pufferben. Az így kapott víztiszta oldat megfelelő formába öntve 32-40°C körüli hőmérsékletre hűlve megszilárdul, és térhálós szerkezetet alkot oly módon, hogy a lineáris polimer szálak dupla helikális szerkezetbe rendeződnek, melyeket a jelenlévő vízmolekulák hidrogén hidak kialakításával stabilizálnak.

Az agaróz jellemzői, típusai

Az agaróz legfőbb jellemzői az olvadási/ gélesedési hőmérséklet, a gél erőssége, és az elektroendozmózis (EEO). Az agaróz gélek alacsony olvadási hőmérséklete (alacsonyabb, mint a DNS denaturálódási hőmérséklete) lehetővé teszi, hogy a DNS sértetlen maradjon a gél melegítése során. Így lehetővé válik a nukleinsavak gélből történő könnyű tisztítása. A gél további fizikai paraméterei közül az erőssége is fontos, ha a felhasználása mechanikai változásokat vagy kezeléseket is magába foglal, mint pl. a Southern vagy a Northern blot analízis során. Az agaróz EEO-ja (a nem töltött molekulák mozgása a katódon keresztül az elektroforézis során) meghatározza a makromolekulák természetes mobilitását a gélen belül. Az alacsony EEO érték esetén a nukleinsavak gyorsabban vándorolnak növelve az elválasztás hatékonyságét, mert ilyenkor a vándorlást csak a molekulaméret határozza meg.

Az alacsony EEO nagy elektroforetikus mobilitást biztosít a makromolekuláknak, lehetővé téve a rövidebb futást megnövekedett sávfelbontással.

A magas olvadási hőmérséklettel rendelkező agaróz gélek leginkább analitikai elektroforézishez használatosak. Ideális kisméretű 30-2000 bp DNS, RNS és PCR fragmentek elválasztására, illetve Southern valamint Northern blot analízishez.

A) Alacsony olvadáspontú agaróz

Az alacsony olvadáspontú agarózok ideális 1000 bp-nál nagyobb DNS és RNA fragmentek elválasztására, illetve nukleinsavak agaróz gélből történő visszanyerésére, mivel olvadási hőmérsékletűk 65.5°C, ami alacsonyabb, mint a legtöbb nukleinsav olvadási hőmérséklete. Az oldat folyékony állapotban marad 37°C-on, míg 25°C alatt gyorsan megszilárdul. Az alacsony olvadáspontú gél a precíz analízisekhez, beleértve az enzimekhez kapcsolt reakciókat, mint a klónozás, a PCR, restrikciós hasítás, ligálás, vagy fluoreszcens illetve radioaktív jelölések a legalkalmasabbak. A klónozáshoz, PCR-hez, szekvenáláshoz szükséges DNS kinyerhető a felolvasztott gélből.

B) Nagy felbontású agaróz

Ebbe a csoportba tartozik a közepes gélesedési hőmérséklettel rendelkező agaróz, mely alkalmas kisméretű DNS és RNS fragmentek elválasztásra 20-800 bp hosszúságban. Ideális DNS és RNS molekulák visszanyerésére, valamint kisméretű nukleinsavak analitikai és preparatív elektroforézisére. Az erősebb gélszerkezet következtében a gél kezelése könnyebb, a gél tisztasága és láthatósága nagyobb lesz.

A nukleinsavak vándorlását befolyásoló tényezők

DNS molekula mozgási sebességét több tényező is befolyásolja. Ilyenek a molekula mérete, az agaróz koncentrációja, a DNS konformációja, az alkalmazott feszültség, a festék jelenléte vagy a puffer összetétele.

A molekula mérete

Az elektromos tér hatására a kettős hélixet alkotó DNS molekula a méretének fordított logaritmusával megfelelő sebességgel vándorol a gélben. Azaz a nagyobb DNS darabok lassabban, a kisebbek gyorsabban mozognak (11.2. ábra). Ez részben a korábban tárgyalt molekulaszűrő hatással illetve a nagyobb súrlódási ellenállással magyarázható, mivel a nagyobb molekulák átjutása a gél pórusain nehezebb.

Kettősszálú DNS vándorlása 0,5-1,4 % agaróz gélben

11.2. ábra Kettősszálú DNS vándorlása 0,5-1,4 % agaróz gélben. A diagram az agaróz gélben a DNS molekula által megtett távolság (x tengely) függvényében mutatja a molekula méretének logaritmikus értékét (y tengely)

A molekula mérete és a gélben megtett vándorlási távolság között a kapcsolat logaritmikus és nem lineáris. Ezért a nagy fragmentek közelebb vannak egymáshoz, míg a kis fragmentek messzebb vándorolnak. A kisméretű fragmentek festés után széles gyenge sávokat mutatnak a gélben. Ennek oka, hogy a sávok intenzitása függ a DNS molekulába beépült etídium bromid mennyiségétől. Mivel a kisebb nukleinsav fragmenteknek kevesebb bázisból épülnek fel, ahova az etídium-bromid be tud épülni, így a kisebb molekulák intenzitása alacsonyabb lesz. Továbbá, ahogyan a molekulák egyre messzebb haladnak a gélben, úgy a DNS egyre inkább hajlamos a diffúzióra. Ezért a kisebb fragmentek homályos sávokat fognak képezni. A laboratóriumi gyakorlatban leggyakrabban használt 1%-os agaróz gél leginkább közepes méretű fragmentek megkülönböztetésére alkalmas, és gyakran alkalmatlan nagyon nagy és nagyon kicsi molekulaméretű DNS molekulák elválasztásra.

Az ismeretlen méretű DNS molekulák méretének megállapításához ismert méretű DNS darabokból álló standardot alkalmaznak, és ehhez viszonyítják annak mozgékonyságát. Az ismeretlen DNS méretének megállapításához legtöbbször a λfág HindIII restrikciós enzimmel történő emésztésével nyert fragmentumait használnak. Újabban népszerű az ún. „1 kb-os létra” (gyári DNS-fragmentum keverék) alkalmazása.

Az agaróz koncentrációja

A nukleinsavak vándorlását meghatározó harmadik tényező, a gél koncentrációja. Az alkalmazott agaróz koncentrációja meghatározza a gél sűrűségét és a pórusok méretét. A háló pórusméretének növelése megkönnyíti a nagy molekulájú DNS fragmentek áthaladását, míg a háló méretének csökkenése késlelteti a kisméretű molekulák haladását, ami csökkenti a diffúzió mértékét is.

A gyakorlatban használatos agaróz gélek koncentrációja általában 0,5-3% között változik. Kisebb DNS-molekulák elválasztásához töményebb (pl. 150 bp DNS – 2%-os gél), még nagyobb DNS-molekulákhoz hígabb (pl. 1500 bp-os DNS-hez 0,8 %) gél használatos. A gél sűrűsége a nukleinsavak szétválasztására van hatással. A gél átlagos pórusmérete megszabja, hogy a gél milyen méretű DNS darabokat tud hatékonyan szétválasztani. A DNS mozgékonysága és a gél koncentrációja között a következő összefüggés írható fel:

logµ = logµo – KrT

ahol a µ mobilitás a Τ pedig a gél koncentráció.

A DNS konformációja

A DNS mérete mellett annak alakja is befolyásolja a vándorlás sebességét; a szuperhelikális, cirkuláris és lineáris DNS mozgékonysága az elektroforézis körülményeitől (áramerősség, ionerősség) függő módon eltérő.

Az azonos molekulasúlyú zárt cirkuláris (I. forma), nicked cirkuláris (II. forma) és a lineáris (III. forma) DNS különböző sebességgel vándorol az agaróz gélben. A három forma relatív mobilitása elsősorban az agaróz koncentrációjától függ, de hat rá az áramerősség, a puffer ionerőssége és az I. formán levő szuperhelikus menetek sűrűsége.

Alkalmazott feszültség, festék jelenléte

Az elektroforézis során az ionok vándorlási sebességét a töltéssűrűségük és az alkalmazott feszültség- gradiens nagysága szabja meg. A feszültség-gradiens egyenesen arányos a két elektród közötti feszültségkülönbséggel és fordítottan arányos az elektródok távolságával. Az elektródok távolsága a készülék geometriájától függ; mivel az elektródok fix beépítésűek, ezt a tényezőt nem áll módunkban megváltoztatni. Szabályozható viszont az elektródokra kapcsolt egyenáramú áramforrás feszültsége. Minél nagyobb a feszültségkülönbség (egy bizonyos határig), annál gyorsabb az elválasztás, azonban a nagy feszültséghez nagyobb áramerősség tartozik; ami a futtató puffer és a készülék felmelegedéséhez is vezet. Nagyobb hőmérsékleten gyorsabb a diffúzió mértéke is, ami rontja az elválasztás hatékonyságét. Ezért olyan optimális feszültséget kell megválasztani, ami a lehető legrövidebb idő alatt megfelelő elválasztást biztosít. A futtatáshoz ajánlott feszültség 5 V/cm.

A puffer összetétele

Elektroforézis puffer összetétele: A DNS mobilitása az elektromos térben függ az elektroforézis puffer összetételétől és ionerősségétől is. Ionok hiányában (pl. nem elektroforézis pufferrel készített gél esetében) az elektromos vezetőképesség minimális és a DNS csak lassan, vagy egyáltalán nem mozog. Ha a puffer ionerőssége túl magas (pl. 10x töménységű elektroforézis puffer használatánál), a vezetőképesség nagyon nagy lesz, ami jelentős hőképződéssel jár. Legrosszabb esetben a gél megolvadhat, és a DNS denaturálódhat.

Több elektroforézis puffer ismert a gyakorlatban. Ezek a pufferek ionokat biztosítanak az adott pH fenntartására egy viszonylag konstanst értéken. Az elektroforézishez leggyakrabban használt puffer a Trisz/acetát/EDTA összetételű TAE, illetve a Trisz/Borát/EDTA TBE pufferek.

További pufferek, mint pl. a lítium borát (LB) meglehetősen ritkán használatosak. A legtöbb esetben alacsony áramerősség (ami kevesebb hőt termel) és/vagy azonos ion mobilitás jellemző rájuk, ami hosszabb puffer élettartalmat eredményez. A borát használata a pufferben azonban problémás lehet, mivel polimerizációra képes, illetve kapcsolatba léphet az RNS-ben is található cisz-diol kötésekkel. A TAE-nek van a legalacsonyabb puffer kapacitása, de a legjobb minőségű elválasztást biztosítja a nagy molekulaméretű DNS molekulák elektroforézist során. Ilyenkor nagyobb feszültségen és hosszabb ideig történik az elválasztás, de jobb minőségű terméket eredményez.

DNS tisztítás agaróz gélből

Az elektroforézist követő gélből történő izolációs technikák a szükséges DNS szakasz visszanyerését teszik lehetővé. A kinyerés után a fragmentek összekeverhetők, lecsaphatók majd enzimesen összekapcsolhatók, ligálhatók.

A nukleotidok agaróz gélből történő visszanyerésére több módszer is létezik. A módszer kiválasztásánál fontos figyelembe venni a DNS hozamot és a tisztaságot. Az agaróz számos szennyeződést tartalmazhat, ami gátolhatja a visszanyerés folyamatát, ha nem megfelelően választjuk el az agarózt a nukleotidoktól. A kereskedelmi forgalomban kapható modern tisztító oszlopokat tartalmazó kitek egyidejűleg végzik a DNS tisztítást és az enzimek aktivitásának gátlását, ezért nagyon jók a szennyeződések eltávolítására, míg a korábbi módszerek kevésbé hatékonyak.

Első lépésben az etídium bromiddal megfestett DNS molekulákat UV fénnyel világítják meg a keresett DNS fragment azonosítására. A DNS mutagenezis elkerülésére az UV fénnyel történő megvilágítás idejének minimálisnak kell lennie. Ezután az azonosított DNS molekulát pengével elválasztjuk a gél többi részétől. A kivágott gél tartalmazza a számunkra érdekes DNS fragmentet. Alternatívaként SYBR Safe DNA gél festék használható a DNS töredezés elkerülésére. Ezután a melegítéssel az agaróz gél felolvasztható, majd a nukleotidok oszlopon tisztíthatók, illetve a mosási lépések után visszanyerhetők. A legtöbb módszer hatékonysága azonban alacsony.

Elektroelúció

A legnépszerűbb alternatív módszer a teljes DNS tisztításra az elektroelúció. Az elektroelúció legközvetlenebb módja, ha a DNS sávot kivágjuk a gélből, majd egy dialízis membránzacskóba helyezzük. Ezt a membránt aztán elektroforézis pufferrel töltjük meg, majd elektromos térbe helyezzük. A DNS-ek kivándorolnak a gélből a pufferbe, majd a puffert benne a benne lévő DNS molekulával együtt összegyűjtjük a membránból. A nukleinsavak alkoholos kicsapás után felhasználhatók további enzimes, kémiai és biológiai reakciókban.

Agaráz

Az agaráz enzim specifikusan emészti a poliszacharidokat agaro-oligoszacharid magokra. Az agaráz enzim lehetővé teszi a nukleotid fragmentek hatékony visszanyerését alacsony olvadáspontú agaróz gélből. Az így visszanyert nukleinsavak közvetlenül használhatók klónozáshoz vagy a szevenáláshoz. Kíméletes, nagy hatékonyságú módszer, mely ideális mind hosszú, mind rövid (<100 bp) DNS fragmentek visszanyerésére. Az enzim aktív TAE és TBE elektroforézis pufferben egyaránt.