11.3. Váltott elektromos mezejű gélektroforézis (Field Inversion Gel Electrophoresis)

I984-ben Schwartz és Cantor írták le először a pulzáló mezejű (pulsed field) gélelektroforézist (PFGE), bevezetve ezzel egy új módszert a DNS elválasztására. PFGE először tette lehetővé extrém nagyméretű DNS fragmentek elválasztását, növelve a DNS elválasztás méretkorlátait a 30-50 kb-tól egészen a 10 Mb-ig. Így nagyszámú kisméretű fragment klónozása helyett a PFGE lehetővé teszi kisszámú, nagyméretű genom darabok analízisét és klónozását.

Alkalmazása: mesterséges élesztő kromoszóma klónozása, fizikai térképezés, in vivo kromoszóma degradáció és törés detektálása, kromoszóma méretek meghatározása és detektálása.

Elmélete: A folyamatos elektromos térben a 30-50 kb-nál nagyobb DNS molekulák a mérettől függetlenül együtt mozognak, kb. elakadnak az agaróz hálóban, eltömik a gélt. Ez a gélen egy nagy diffúz sávként tűnik fel. Ha a DNS-t a mozgás irányának megváltoztatására kényszerítjük, akkor a különböző méretű fragmentek ezen a diffúz sávon belül elkezdenek szétválni egymástól, ki tudnak kerülni a „kátyúból” és elválaszthatók. Az elektromos mező átrendeződése következtében a kisméretű DNS molekulák gyorsabban kezdenek az új irányba mozogni, mint a nagyobb nukleotidok. Így lehetővé válik a nagyobb fragmentek elválasztása a kisebb méretű DNS molekuláktól.

Forgó gélektroforézis (RGE)

Az RGE az egy leggyakrabban használt fajtája a pulzáló mezejű technikáknak. Az elektródok meghatározott polaritással az ellentétes oldalakon helyezkednek el a pufferben. A DNS új irányba történő elválását a gélben egy mágneses hajtómű egyszerű elforgatásával lehet elérni. Mivel a DNS orientációs szögét egy mechanikus kapcsolás határozza meg, így a RGE nagy rugalmasságot biztosít a gél futtatás során viszonylag alacsonyabb költségek mellett.

Számos paraméter szerepet játszik a PFGE-vel történő elektroforézis során. Ilyen az alkalmazott feszültség és elektromos mező erőssége, a pulzusok hossza, a re-orinetáció szöge, az agaróz típusa és koncentrációja, az alkalmazott standardok, és ha lehetséges, akkor a feltöltött DNS mennyisége. Pl: egy 18x20 cm-es 1-1,2%-os agaróz gél futtatása 1-8V/cm feszültséggel, 100-120 fokos orientációs szöggel, 60-120s pulzushosszal. A futtatás ideje 16-50 óra.

Agaróz gél készítése

Készítünk egy 1%-os (vegyes %) agaróz gélt (100 ml 1x TAE pufferben 1g agarózt teszünk). Mikrohullámmal 1-2 percig (szakaszosan) melegítjük, gyakran rázogatjuk. A jó agaróz oldat vízszerű, áttetsző, sűrűbb agaróz szemcséket nem tartalmaz. Ha már homogén és teljesen víztiszta, akkor kb. 50-60 oC-osra hűtjük, majd a gélt beleöntjük az előre elkészített gél tálcába. A gél méretétől függően legalább 20-40 perc dermedési időt kell hagyni, mielőtt a "fésűt" és a szigetelő szalagokat (léceket) eltávolítjuk. A megszilárdult gélt behelyezzük az elektroforézis kádba úgy, hogy a puffer ellepje (kb. 1 cm-rel). Óvatosan kihúzzuk a fésűt a gélből és eltávolítjuk a ragasztószalagot a tálca két végéről. A zsebek sérülésének megakadályozásához a zsebek környékén a gél felületére 1xTAE oldatot csepegtetünk.

A mintákhoz hozzáadunk 2 µl „sample loading dye”-t, majd óvatosan 7 µl-t bepipettázzuk a gélen lévő zsebekbe, a puffer alá rétegezve. A minták mellé standardként 7 µl DNS létrát vagy HindIII-mal emésztett λ-fág DNS-t viszünk fel. A gélt a futtatókádba helyezzük és feltöltjük pufferrel (kb. 600 ml 1xTAE) (11.3. ábra). Bekapcsoljuk a tápegységet, ügyelve a polaritásra (a DNS a pozitív sarok felé vándorol). A mintákat 100 V feszültségen 0,5-1 órát futtatjuk. A „sample loading dye” (Biorad) két kék festéket tartalmaz, amelyek nem festik meg magát a DNS-t, de megkönnyítik a zsebek megtöltését és segítik az elektroforézis állásának nyomon követését. A „gyorsabb” festék a brómfenolkék a körülbelül 300 bp méretű, a „lassabb” a körülbelül 2,5 kb méretű DNS fragmentekkel vándorol együtt. A gél futását a brómfenolkék állása alapján követjük, ált. akkor állítjuk meg, ha kb. 1 cm-re van attól, hogy kifusson. A futtatás után a DNS fragmentek elhelyezkedését festési eljárás segítségével vizsgáljuk. Az elektroforézis befejezése után a gélt 5 percre etídium-bromid oldatba áztatjuk, majd UV lámpa alatt vizsgáljuk.

Nukleotid minta felvitele és futtatása agaróz gélben

11.3. ábra Nukleotid minta felvitele és futtatása agaróz gélben. A mintát pipetta segítségével visszük fel a gélre a mintatartó zsebbe, majd a gélt pufferben elektromos erőtérbe helyezzük.

A gélkép alapján nyerhető információk:

- A DNS sávok helyzete és intenzitása felvilágosítást ad a minta tisztaságáról. Ha a várt sáv (ok) mellett további sáv(ok) is észlelhetők, ez a minta szennyezettségére utal. A várt és extra sávok intenzitása a szennyezés mértékéről ad tájékoztatást. Elképzelhető, hogy a szennyezés a minta degradációjának eredménye, ilyenkor a vártnál kisebb méretű extra sávok jelennek meg. Az aspecifikus módon degradálódott DNS nem ad jól elkülöníthető sávokat, a gélen széles mérettartományban detektálható festődés. Hasonlóan elmosódott sávot okozhat mRNS szennyezés is.

- Ha a minta DNS pontos koncentrációját nem ismerjük, a sáv(ok) intenzitásából következtethetünk a felvitt minta körülbelüli koncentrációjára. Ilyenkor célszerű a mintából különböző térfogatokat felvinni egymás melletti zsebekbe és a festődés intenzitását ismert mennyiségű DNS-t tartalmazó sávok intenzitásával összehasonlítani.

- Lehetőség van az ismeretlen DNS darab méretének meghatározására. Ehhez ismert méretű (standard) DNS minták mozgékonyságával kell az ismeretlen anyag mozgékonyságát összehasonlítani.