11.5. Poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE)

A poliakrilamid gélelektroforézis (polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) a leggyakrabban használatos gélelektroforézis, ahol az elektroforézis során hordozó közegeként poliakrilamid gélt használnak.

Bár a PAGE végrehajtása jóval körülményesebb, a módszer több előnnyel is rendelkezik az agaróz gélelektroforézissel szemben:

1, Kisebb méretű fragmentumok elválasztására alkalmas az akrilamid koncentrációjától (3,5%-20%) függően 1000-6 bp.

2, A felbontása sokkal nagyobb, akár 0,2% különbség is kimutatható DNS fragmentumok méretében.

3, Sokkal nagyobb mennyiségű DNS-t lehet egy zsebbe tölteni, mint agaróz gél esetében (akár 10µg/zseb).

4, A poliakrilamid gélből izolált DNS nagyon tiszta, így a DNS tisztaságára kényes módszereknél (pl. embriók injektálása) is felhasználható

Az akrilamid vizes oldatban, megfelelő katalizátorok és iniciátorok jelenlétében gyökös polimerizációra képes, és a reakció során nagy mólsúlyú lineáris polimer, ún. poliakrilamid keletkezik. Ez utóbbi vizes oldata rendkívül nagy viszkozitású. Megfelelő keresztkötő ágens, N,N-metilén-bisz-akrilamid jelenlétében a hosszú poliakrilamid láncok között "hidak" képződnek, és térhálós szerkezetű gél jön létre. Az elektroforézis során a nukleotidok ebben a gélben vándorolnak.

Az poliakrilamid gél nagy felbontóképességnek oka, hogy a relatív töltések különbségén alapuló elválasztással egy időben a gélben a molekulák méret és alak szerint is elválnak egymástól. Ezt a hatást a gél átlagos pórusmérete szabja meg, ami az akrilamid-monomer koncentrációjának és a térhálósító metilén-bisz-akrilamid százalékos arányának megválasztásával változtatható. A gél mechanikus tulajdonságai leginkább a kb. 4-20% akrilamid koncentráció-tartományban kedvezőek. A keresztkötő metilén-bisz-akrilamid mennyisége az alkalmazott akrilamid-monomernek rendszerint 1-3%-a. A poliakrilamid gélek előnyös tulajdonságai, hogy hidrofilek, kémiailag közömbösek, stabil vegyületek, az elválasztandó molekulákkal nem lépnek specifikus kölcsönhatásba, nem zavarják a detektálására szolgáló festési reakciókat, valamit kompatibilisek a legtöbb általánosan használt puffer rendszerrel.

A polimerizáció a TEMED (tetrametil-etiléndiamin) és az APS (ammónium-perszulfát) hozzáadásával indukálható. Az APS egy szabad gyököt tartalmaz, mely aktiválja a TEMED-et, ami a továbbiakban aktiválja az akrilamid monomert. Az aktivált és a nem aktivált monomerek reakciója elindítja a polimerizáció folyamatát. A meghosszabbodott polimer lánc pedig keresztbe köt a bisz-akrilamiddal.

A polimerizációs folyamat fizikai-kémiai tulajdonságain túl, az alkotóelemek tisztasága, különösen a poliakrilamidé, meghatározza a gél minőségét. A katalizátor anyagok mennyiségének csökkentése hosszabb polimer láncokat eredményez, ami növeli a gél tisztaságát és növeli annak nyújthatóságát. Az alapanyagokon túl egyéb tényezőknek, mint a reakció hőmérsékletének és az oxigén koncentrációjának is fontos szerepe van az elkészített gél minőségében. A polimerizáció exoterm folyamat, mely során a kezdetben kibocsátott hő gyorsítja a folyamatot. Az alacsony hőmérsékleten (4ºC) polimerizált gélek rugalmatlanok lesznek, míg a magas hőmérsékleten (25ºC) történő polimerizáció átlátszó, kevésbé porózus, rugalmas gélt eredményez.

A nukleotidok szétválasztásához használt poliakrilamid gélt üveglapok közé öntik. Az üveglapok közötti távolságtól függően különböző vastagságú gél önthető. Az üveglapoknak szennyeződés és nukleáz enzimektől mentesnek kell lennie.

Az agaróz gélhez hasonlóan a poliakrilamid gél koncentrációja meghatározza az elválasztható fragmentek méretét (11.4. ábra).

A: DNS agaróz gélektroforézis kétfajta festékanyaggal. B: Eltérő mennyiségű DNS molekulák poliakrilamid gélelektroforézise etídium bromid festékkel.

11.4. ábra: A: DNS agaróz gélektroforézis kétfajta festékanyaggal (fent). B: Eltérő mennyiségű DNS molekulák poliakrilamid gélelektroforézise etídium bromid festékkel (lent).

A DNS molekulák függőleges gélelektroforézise a genetikai térképezéshez, a fragmentek klónozásához tökéletesen megfelelő. Ha a vizsgálni kívánt nukleonid molekula mérete 1000 bázispár alatti, az elválasztás felbontása szignifikánsan romlik, ami alternatív módszer használatát teszi szükségessé. A poliakrilamid gél 5% akrilamiddal már meggyőző elválasztási rendszert biztosít 10 bp-ig a fragmentek vizsgálatához.

A poliakrilamid gélek egy bázispárnyi különbségek kimutatására is alkalmasak lehetnek pl. PCR termékek esetében. Az elválasztás specifikussága nem csak a termékek (nukleinsavak) méretétől, illetve a DNS töltésétől függ, hanem azok másodlagos szerkezettől is, ezért szükséges a konformáció okozta különbözőségek megszüntetése. Ez denaturáló gélen történő elektroforézissel érhető el, ami olyan denaturáló szereket tartalmaz, mint a nátrium hidroxid, a karbamid, metil-higany hidroxid, formaldehid és a nátrium dodecil szulfát (SDS).

A nem denaturáló poliakrilamid géleket natív géleknek is nevezzük, melyben a nukleinsavak elválasztása detergensek jelenléte nélkül történik. A denaturáló gélekkel ellentétben a natív gélek alacsony, 1-8 V/cm feszültségen futnak.

Detektálás

Az etídium-bromiddal történő DNS festés a legjobb választás, mivel gyors, egyszerű és összehasonlíthatóan érzékeny. A DNS vagy RNS molekulák a poliakrilamid gélen ezüstfestéssel is láthatóvá tehetők. Az ezüstfestés hozzávetőlegesen 2-10 szer érzékenyebb módszer, mint az etídium-bromidos. Különösen a denaturáló gélek esetében ajánlott az ezüstfestés, mert az etídium-bromid festés ezekben a gélekben gyorsan elhalványul.

A gél fixálása során használt oldatok tioszulfát tartalma teszi lehetővé a nukleinsavak festésének fejlesztését és a detektálását nanogramm tartományban is. A meglehetősen mérgező etídium-bromid kiváltására szolgál a kevésbé káros SYBR® Safe festés, mely egy érzékeny festési módszer a DNS vizualizálására agaróz és poliakrilamid gélben egyaránt.